Cтраница 4
Это выполняется чаще всего осаждением вытяжки спиртом ( этиловым, изопропиловым), но возможны, естественно, и иные способы выделения ферментов из нее, например высаливанием. При осаждении спиртом необходимо вытяжку и спирт предварительно охлаждать ( до 5 С), чтобы избегнуть инактивации ферментных белков. Кроме того, при этом способе нужно систематически регенерировать значительные количества спирта, что не представляет сложной задачи. Здесь дается технологическая схема производства сухого спиртоосажденного препарата из Asp. Производство этого препарата, равно как и других, подобных ему, состоит из двух частей: а) выращивание поверхностной культуры гриба и получение из нее диффузионной вытяжки; б) концентрирование фермента осаждением спиртом, стабилизация его ( и формирование осадка) прибавлением СаС12, высушивание, измельчение. [46]
Во время обработки тканей органическими растворителями ( ацетоном, спиртом и др.) при низкой температуре происходит обезвоживание, которое и приводит к разрушению клеток. Получаемые при этом сухие ацетоновые препараты могут долгое время храниться без потери ферментативной активности и служат хорошим исходным материалом для получения и высокой очистки многих ферментных белков. Автолиз клеток, их разрушение действием лизоцима или иных добавляемых извне ферментов часто применяют при обработке дрожжей, бактерий, микроскопических грибов. Дефект этих приемов в том, что в получаемых растворах выделяемый белок бывает довольно сильно загрязнен побочными веществами. [47]
Выделение из сырья ферментных белков, получение концентрированных различной активности ферментных препаратов также могут быть более экономичными. Здесь должны вводиться наиболее совершенные технологические схемы, с применением самых доступных солей для высаливания, минимальных количеств органических растворителей, наиболее простых способов выделения ферментных белков, их очистки, адсорбции и элюции. [48]
Коферменты надо рассматривать как более или менее легко отделяемые от белковой части фермента простети. Эта их функция стала особенно очевидной после того, как было показано, что многие окислительно-восстановительные процессы катализируются системой, состоящей из одного кофермента и двух различных ферментных белков. [49]
CuCl, AgNO3), так и в форме органических соединений ( таких, как п-гидроксимеркурибен-зоат) они связывают SH-группы и тем самым глубоко изменяют третичную и четвертичную структуру ферментных белков. Блокируется также функциональная сульфгидрильная группа кофермента А. Цианид действует как дыхательный яд-связывая железо, он блокирует функцию терминального дыхательного фермента цитохромоксидазы. Ан-тимицин А нарушает перенос электронов по дыхательной цепи, ингибируя цитохром-с-редуктазу. Динитрофенол разобщает процессы окисления и фосфорилирования в митохондриях. Арсенат ингиби-рует фосфорилирование на уровне субстрата. Фторацетат блокирует цикл трикарбоновых кислот. Сначала он, подобно ацетату, активируется и используется как предшественник цитрата ( так называемый летальный синтез), а образовавшийся фторцитрат ингибирует аконитазу и тем самым тормозит дальнейшие превращения цитрата. [50]
Многие исследователи считают, что определяющая роль в термофилии принадлежит белкам, в первую очередь ферментным. С этих позиций основные температурные точки термофилов зависят от конформации одного или нескольких ключевых ферментов: при минимальной температуре роста происходит переход от жесткой неактивной конформации белковых молекул к конформации с ограниченной гибкостью; оптимальная температура роста определяет наиболее благоприятное конформационное состояние ферментных белков; при максимальной температуре начинаются нарушения конформации белков и снижение их ферментативной активности, а выше этой температуры рост прекращается вследствие тепловой денатурации белков. [51]
Можно полагать, что ЧПЭ является полиферментной системой с сохранением примерно такой же топографии ферментов, как и в целом митохондрионе, и содержит набор различных осуществляющих окислительно-восстановительные реакции компонентов, через которые электроны переходят от сукцината, или НАД-Н2, к молекулярному кислороду. В этом наборе содержится не меньше шести различных белков с функциональными группами окислительно-восстановительного характера, в том числе два флавопротеидных фермента и четыре цитохрома. Эти ферментные белки в цепи переноса электронов содержатся в следующих пропорциях: на каждую молекулу флавопротеида НАД-Н2: цитохромредуктазы приходится одна молекула флавопротеида сукцинатдегидрогеназы, одна молекула цитохрома с, одна молекула цитохрома с, три молекулы цитохрома Ъ и шесть молекул цитохрома а. Кроме того, на одну молекулу сукцинатдегидрогеназы приходится около 11 атомов негеминового железа, 4 атома меди и 15 молекул убихинона. [52]
Никаких данных о влиянии температуры на пятеричную структуру белков практически нет, но имеется ряд веских априорных соображений в пользу того, что изменения температуры могли бы существенно сказываться на этом уровне макромоле-кулярной организации. Это в особенности касается ферментов, связанных с мембранами. Присоединены ли ферментные белки просто к поверхности мембраны или же они включены в ее внутреннюю структуру, в любом случае здесь почти наверняка участвуют слабые связи или взаимодействия. Поэтому представленные выше данные о влиянии температуры на слабые связи, стабилизирующие третичную и четвертичную структуру, вероятно, позволяют сделать аналогичные выводы и относительно пятеричной структуры. [53]