Cтраница 2
Величины Р5о, подобно / ( л и 50 5, обычно того же порядка, что и концентрации газа ( или субстрата) в среде, окружающей активный белок. Так же как и параметры сродства ферментов к субстратам, величина А о необычайно чувствительна к изменению физического и химического состояния клеточной среды. [16]
Прежде всего, в условиях, которые определяют восстановление нитратов в растениях, освобождение азотной кислоты из азотнокислых солей, как мы увидим дальше, почти не вызывает сомнений, и поэтому несколько таинственное участие активного белка совсем не кажется оправданным. Далее, опыт с глюкозой, азотнокислым калием и платиновой чернью - опыт, призванный доказать роль каталитического действия, - не кажется мне убедительным. Не следует ли предположить также, что при комбинированном действии азотнокислого калия и кислот, получающихся путем окисления части глюкозы в присутствии платиновой черни, свежеприготовленная чернь образует, хотя бы в минимальном количестве, соединение, которое уже легко восстанавливается глюкозой. [17]
Аминокислотные остатки располагаются всегда строго линейно, плечом к плечу, подобно солдатам, стоящим по стойке смирно. Но так устроен и биологически активный белок, и белок, нагретый, скажем, до 60 С, когда он уже полностью теряет свою биологическую активность. Необходима еще совершенно определенная укладка в пространстве групп, закодированных на рис. 2 в виде сокращенных названий аминокислот, которые на самом деле вовсе не кружочки и не шарики, а имеют каждая свою весьма причудливую форму. [18]
Заметим, однако, что для некоторых других систем наблюдается комплементация в пределах одного и того же класса. Это оказывается возможным в том случае, если активный белок состоит из двух или нескольких идентичных полипептидных субъединиц и если эти субъединицы, будучи поврежденными в разных местах, сохраняют способность агрегировать с образованием более или менее активного белка. [19]
Молекулы, способные выполнять функцию матрицы. При синтезе специфического полипептида, являющегося структурной частью биологически активного белка, роль такой матрицы играет полирибонуклеотид, в котором полностью и точно транскрибирована нуклеотидная последовательность соответствующего генетически активного участка ДНК. [20]
Если в качестве аффинного лиганда используется кофактор, согласно данным Лоу и Дина [57], очень важно, чтобы натив-ная конформация кофактора сохранялась даже после его связывания. Это справедливо также в том случае, если аффинным лигандом является биологически активный белок. Он должен быть присоединен к носителю минимально возможным числом связей, так как при этом увеличивается вероятность сохранения нативной третичной структуры белка. Куатреказаса по выделению инсулина [14] на колонке с сефарозой с присоединенными при рН 6 5 или 9 5 антителами к свиному инсулину. Как будет показано ниже, белок связывается с активированной бромцианом сефарозой посредством непротонированных аминогрупп. Снижение рН уменьшает число связавшихся групп. [21]
Если биологическая активность белка служит критерием степени его очистки, то всегда желательно определять активность каждой из фракций. Регенерация полной исходной активности может считаться признаком того, что в ходе производившихся операций активный белок не претерпел никаких изменений. С другой стороны, отсутствие восстановления исходной активности может указывать на разрушение белка или на потерю существенно важного для реакции компонента, например кофермента. Кроме того, полезно сравнивать в каждой фракции различного типа активности, так как иногда случается, что в одной фракции достигается лучшая степень очистки, а в другой - больший выход. Если потери выделяемого вещества допустимы, то более желательной может быть первая фракция. [22]
Не менее важно и чисто практическое значение стабилизации. Предохранение фермента необходимо: а) в сырье, при его сохранении и в момент выделения из него активного белка; б) на всех этапах технологической схемы производств любого ферментного препарата; в) во время хранения готовых препаратов; г) в процессе их применения, при физико-химических условиях данной сырьевой системы, в конкретных технологических условиях, ибо возможна интенсивная инактивация фермента во время обработки им различных материалов. [23]
Лев считает, что восстановительное действие живой протоплазмы должно быть приписано некоторому активному белку, являющемуся промежуточным членом между обычным белком и организованным белком живой протоплазмы. Этот белок имеет такой же состав, как и обычный пассивный белок, но отличается от него расположением элементов, определяющим большой запас энергии активного белка, но в то же время и его крайнюю неустойчивость. Переходя из активного состояния в пассивное, белок выделяет энергию в виде теплоты. [24]
Для того чтобы активный белок обладал восстановительной способностью, он должен иметь альдегидные свойства. С другой стороны, для того чтобы он мог выделять энергию в результате интрамолекулярного перемещения атомов, нужно, чтобы в присутствии альдегидных групп активного белка находились другие группы, с которыми они могли бы реагировать внутри молекулы. Как известно, альдегиды чрезвычайно легко соединяются с амидами. Так как амидная природа белка не вызывает никаких сомнений, то Леп считает, что активный белок содержит в несвязанном виде многочисленные альдегидные и амидные радикалы и поэтому имеет большой запас энергии. Как только оба типа радикалов соединяются, активный белок теряет свойства альдегида и становится пассивным, выделяя энергию. Эта энергия играет, как мы скоро увидим, существенную роль в восстановлении нитратов. [25]
При помощи радиоактивного ДФФ найдено, что 1 моль фермента присоединяет 1 1 моля фосфора, а химическим анализом установлено, что в молекулу внедряются две изопропильные группы и совсем не вводится фтор. Ни одна из встречающихся в химотрипсине аминокислот не реагирует с ДФФ, а кристаллический ингибированный фермент содержит такое же количество аминного азота, что и активный белок. [26]
Заметим, однако, что для некоторых других систем наблюдается комплементация в пределах одного и того же класса. Это оказывается возможным в том случае, если активный белок состоит из двух или нескольких идентичных полипептидных субъединиц и если эти субъединицы, будучи поврежденными в разных местах, сохраняют способность агрегировать с образованием более или менее активного белка. [27]
Образование полисом как in vivo, так и in vitro можно наблюдать не только с природными молекулами тп - РНК, но также с различными полирибо-и полидезоксирибопуклеотидами, в том числе с синтетическими гомо - и гете-рополимерами. Если ввести в бесклеточную систему смесь s - PHK, ацилиро-ванных соответствующими аминокислотами ( или s - PHK свободные амино-кислоты аминоацил - s - PHK-синтетазы - f АТФ), трансферные и инициирующие ферменты, ГТФ, а также ионы Mg 2 и К, то в системе будет происходить синтез активного белка или полипептида. Именно эти факты, обнаруженные в опытах по синтезу полипептидов на полинуклеотидных матрицах, о которых сообщили в 1961 г. Ниренберг и Маттеи, а затем Ленгиел, Спейер и Очоа, позволили окончательно расшифровать генетический код. [28]
На колонку наносят около 2 мл раствора белка и пропускают раствор, используемый для уравновешивания колонки. Анализируют фракции элюата, определяя в них содержание белка и активность фермента. Собирают и объединяют фракции, содержащие наибольшее количество активного белка. [29]
Появляется опа-лесценция, которая постепенно увеличивается, выпадают шелковистые нити. В последующие дни насыщение постепенно увеличивают не более чем на 0 1 - 0 2 в день. После получения конечного насыщения ( 0 8) весь активный белок кристаллизуется в течение двух дней. [30]