Амплификация
Cтраница 2
 |
Секвенирование ДНК методом праймер-опосредованной прогулки. 1. Инициация синтеза цепи ДНК с помощью праймера ( Р1, комплементарного участку плазмиды, находящемуся вблизи вставки. [16] |
Их амплификация - иногда в миллионы раз - осуществляется в ходе трехэтап-ного циклического процесса. ДНК-по-лимераза, которая не теряет своей активности при температуре 95 и выше; 4) четыре дезокси-рибонуклеотида. [17]
После амплификации этот фрагмент без труда обнаруживается с помощью электрофореза в полиакриламид-ном геле. Незначительно варьируя методику проведения ПЦР ( например, изменяя нуклео-тидную последовательность праймеров), последнюю можно использовать для обнаружения широкого спектра бактерий, вирусов и паразитов. [18]
Фосфорилаза ( а) агрегирует далее и образует тетрамер. Эта стадия усиления ( амплификации:) очень напоминает эффекты электронных цепей. [19]
Моноклональные антитела грызунов, сходные с антителами человека, можно получить, выделив кДНК L - и Н - цепей из клеточной линии гибридомы грызунов и амплифицировав их вариабельные области с помощью ГЩР. В качестве праймеров для амплификации можно использовать олигонуклеотиды, комплементарные высококонсервативным сегментам ДНК, фланкирующим с 5 - и 3 -концов последовательность, кодирующую вариабельную область. Зная нук-леотидные последовательности кДНК вариабельных областей легкой и тяжелой цепей ( VL и VH), легко определить границы CDR, основываясь на том, что соответствующие им последовательности гипервариабельны, в то время как каркасные области относительно консервативны. [21]
Этот метод широко применяется для подтверждения гер-песвирусной этиологии менингоэнцефалитов, особенно у детей, для диагностики генитального герпеса. В качестве мишени при амплификации обычно используется общий для ВПГ-1 и ВПГ-2 высококонсервативный участок ДНК гена полимеразы. [22]
При определенных обстоятельствах часть генома может амплифи-цироваться путем повторной репликации одного или нескольких генов. Наиболее широко известным примером является амплификация генов рибосомной РНК ооцитов амфибий. В случае Xenopus избыток ДНК скапливается вокруг ядрышка, а затем распадается, образуя 1000 или больше отдельных ядрышек. Амплифицированная рДНК может служить удобным материалом для биохимических исследований. Так, например, структурные исследования, описанные в предыдущем разделе, были выполнены на ДНК именно этого типа. [23]
Огромным достоинством гибридизационного анализа является возможность резко повысить его чувствительность, используя способность нуклеиновых кислот к самокопированию, приводящему к существенному увеличению числа анализируемых молекул. Этот прием известен под названием амплификации. Если речь идет об определении нуклеиновой кислоты известного строения, то содержание фрагмента этой ДНК длиной в несколько сотен пар нуклеотидов в исследуемом образце можно резко увеличить с помощью ДНК-жшимеразы. С этой целью к образцу добавляют синтетические праймеры, комплементарные 3 -концам, обеих нитей амплифицируемого участка ДНК, выбранных для репликации. В такой системе в присутствии дезоксинуклеозид-5 - трифосфатов и ДНК-полимеразы происходит репликация ДНК, причем именно той, для которой выбраны праймеры. В результате репликации появляются две новые копии с выбранными праймерами на 5 -концах. Процесс может быть продолжен, для чего необходимо расплавить сформировавшийся дуплекс и добавить новую порцию праймера, если он исчерпался. Последующее снижение температуры до уровня, позволяющего образование дуплекса матрица - праймер, позволяет осуществить следующий цикл репликации. Легко подсчитать, что теоретически достаточно 20 циклов, чтобы достичь увеличения количества ДНК в 106 раз. Так как ДНК-полимераза при нагревании может инактивироваться, то предпочтительно использовать специальные ферменты из термофильных организмов. В этом случае фермент выдерживает нагревание вплоть до температуры плавления и нет необходимости добавлять новые порции фермента после каждого цикла амплификации. Описанную процедуру называют цепной полимераэной реакцией или сокращенно ПЦР ( от англ. Она позволяет повысить в миллионы раз чувствительность, открывая таким образом возможность детектирования небольшого числа полинуклеотидных цепей, например несколько частиц вируса СПИДа в исследуемой крови. Гибридизационный анализ образцов, предварительно амплифицированных с помощью ПЦР, открывает перспективу ранней пренатальной диагностики наличия дефектного гена у плода, используя в качестве анализируемого материала небольшое число клеток околоплодной жидкости. На рис. 74 представлена принципиальная схема нескольких первых стадий процесса амплификации. Аналогичным образом можно анализировать РНК, если предварительно провести обратную транскрипцию. [24]
Пара праймеров, которая используется для амплификации левого фрагмента, включает неполностью комплементарный олигонуклеотид, спаривающийся с тяжелой цепью гена-мишени, и обычный, полностью комплементарный праймер, гибридизую-щийся с участком легкой цепи, фланкирующим левый уникальный сайт рестрикции. Один из праймеров, использующихся для амплификации правого фрагмента, содержит некомплементарные нуклеотиды и спаривается с тяжелой цепью гена-мишени, а второй праймер полностью комплементарен участку легкой цепи, фланкирующему второй ( правый) уникальный сайт рестрикции. Продукты ПЦР-амплификации очищают и объединяют, а затем подвергают денатурации и ренату-рации. В результате образуется некоторое количество частично двухцепочечных молекул ДНК, спаренных в области гена-мишени. [25]
PCR), в которой осуществляется амплификация небольших последовательностей, соответствующих одному или немногим генам. Желаемую последовательность однонитевой ДНК получают из мРНК под дей ствием обратной транскриптазы. Она используется в качестве праймера. Затем двунитевую ДНК объекта нагревают для разрьь ва дуплекса, добавляют праймер и подвергают действию ДНК полимеразы. Несколько циклов позволяют копии умножиться экспоненциально. Таким способом можно получить желаемый ген или последовательность; Эта методика позволяет обнаружить искомые последовательности в суммарной ДНК, экстрагированной из микробного сообщества в естественном месте обитания. [26]
В последнее время, кроме генов рРНК коллектив лаборатории исследует гены белков холо-дового шока растений, генов лектинов бобовых растений с целью создания трансгенных растений с различными конструкциями маркерных генов, таких как глкжуронидаза, люцифераза и зеленый флуоресцентный белок под контролем промоторных областей исследуемых генов или их отдельных фрагментов. Для этих исследований понадобился уже метод амплификации ДНК с помощью полимеразной цепной реакции, освоенный сотрудниками в 1992 году. [27]
Хотя в настоящее время имеется несколько тест-систем для выявления гена экзотоксина С. ПЦР, ВОЗ рекомендует применять праймеры для амплификации фрагмента, кодирующего синтез субъединицы А токсина. Выявление гена дифтерийного токсина у нетоксигенных штаммов представляется особенно важным при оценке эпидемиологической ситуации, поскольку репрессированный полноценный ген при определенных условиях способен восстановить экспрессию и выработку токсина, что свидетельствует о потенциальной опасности таких штаммов. [28]
Мир микроорганизмов во всем его разнообразии еще далеко не познан. Данные, полученные с помощью методов молекулярной биологии ( амплификация, разделение и сиквенс генов, кодирующих 16S рРНК) в изучении распространения микроорганизмов, позволяют утверждать, что человек способен культивировать лишь менее 1 % всех микроорганизмов, живущих на Земле. [29]
Аналитические возможности в биохимии нуклеиновых кислот неизмеримо возросли с появлением амплификации, т.е. размножения молекул ДНК с определенной последовательностью нуклеотидов с помощью ДНК-полимеразы. [30]
Страницы: 1 2 3 4