Амплификация

Cтраница 4

Этот термин означает, что незначительные воздействия вызывают сильный эффект. Частным случаем амплификации является известное каждому действие экономических стимулов: затрата определенной суммы на поощрение работников вызывает намного больший по размерам доход государства - благодаря росту выпуска продукции, повышению ее качества, сокращению отходов и др. Параметры системы, обладающие способностью амплификации, обычно избираются ключевыми управляющими параметрами. [46]

Селекции рибозийа с РНК-лигазной активностью. [47]

ДНК-копия непрореагировавшего акцепторного олигонуклеотида амплификации не подвергается. Таким способом проводится вторая селекция. Для продолжения процесса нужно провести транскрипцию той части амплпфнката, который соответствует донорной РНК. После этой повторной амплификации проводится транскрипция и восстанавливается донорный фрагмент, но уже прошедший цикл селекции, т.е. теоретически содержащий только каталитически активный материал, а практически существенно обогащенный по каталитически активным последовательностям. Это дает возможность провести еще один или несколько циклов селекции. [48]

Эти премии были присуждены за разработанные уникальные методы, получившие невероятно широкое распространение и позволяющие исследователям решать ныне самые сверхсложные задачи. Премия 1993 г. была присуждена за метод амплификации ДНК с помощью полимеразной цепной реакции ( К. Несмотря на то, что все эти методы основаны, главным образом, на действии многочисленных ферментов, они были бы невозможны без глубокого знания химии нуклеиновых кислот и, в первую очередь, ДНК. Данное обстоятельство, видимо, и сыграло решающую роль в выборе номинации. [49]

Особенно важное значение имеет выделение, клонирование и анализ разнообразных сигнальных и регуля-торных участков ДНК, таких, как i-гены, промоторы и операторы. В настоящее время с помощью методов клонирования исследуется механизм амплификации генов, т.е. синтеза большого числа копий какого-то одного гена, происходящего в раннем эмбриогенезе. Эти же методы применяются при анализе различных генов позвоночных, которые соединяются с образованием ДНК, кодирующей легкие и тяжелые цепи антител. [50]

Наиболее широко среди перечисленных подходов применяется SSCP. Суть метода состоит в следующем. Как можно большее ( по возможности все) число экзонов исследуемого гена по отдельности амплифицируют методом ПЦР, используя в качестве матрицы ДНК больных и здоровых индивидов. Каждая пара праймеров выбирается из последовательностей, фланкирующих экзон, или из его концевых участков. Кроме того, используя данные секвенирования, выбирают праймеры для амплификации 5 -области, предшествующей первому экзону гена, 3 -области, следующей за последним экзоном, и участков, содержащих сайты сплайсинга. [51]

Развитие иммунной реакции организма на введение чужеродного антигена включает целый ряд этапов и межклеточных взаимодействий. Первоначальный контакт с антигеном, запускающий иммунный процесс, осуществляют макрофаги; при этом антиген попадает внутрь макрофага н претерпевает процессинг - расщепление гидролитическими ферментами с вычленением сравнительно небольших фрагментов, несущих отдельные антигенные детерминанты. Заключительным этапом процессинга является экспрессия ( обратный транспорт) фрагментов на поверхность макрофага, где они оказываются в комплексе с собственными антигенами гнсто-совместимостн II класса ( в случае мышей тек называемыми la - белками, см. с. В свою очередь, Т - хелперы осуществляют развитие заключительных стадий процесса, способствуя образованию эффек-торных клеток - Т - киллеров и плазматических клеток - из соответствующих клеток-предшественников. На всех этапах, требующих межклеточных взаимодействии, важную роль играют растворимые медиаторы иммунного ответа - лимфокины ( белки лимфоцитар-ного происхождения) и монокины ( белки, синтезируемые макро-фагами): эти гормоноподобные белки, вырабатываемые различными популяциями клеток - участников иммунного ответа, вызывают последовательный рост клона и дифференцировку активированных антигеном лимфоцитов. С их помощью достигается амплификация ( усиление) иммунного ответа, они же участвуют в последующей супрессии ( остановке) иммунной реакции; последний процесс опосредуется Т - лимфоцитвми-супрессорвми. Известны и цитотоксические лимфокины - лимфотоксин и фактор некрозе опухолей, осуществляющие эффекторную функцию - лизис трансформированных клеток. [52]

Геном млекопитающих содержит несколько разных семейств коротких повторов. Короткие повторы у птиц и амфибий изучены значительно хуже. Число копий коротких повторов, например наиболее изученных повторов Alu-семейства у человека, составляет 3 - 105, что соответствует 5 - 6 % массы ДНК клетки. Такие повторы рассеяны по геному и получили название вездесущих. Нук-леотидная последовательность Alu-повтора гомологична последовательности отдельных участков 7S РНК - Структура 7S РНК достаточно консервативна у позвоночных, а гомологии в нуклеотидной последовательности прослеживаются и с 7S РНК насекомых. Поэтому семейства коротких повторов, присутствующие у разных видов, предшественником которых служила 7S РНК, также могут обладать достаточной гомологией. В то же время семейства коротких повторов, как и длинных, характеризуются видоспецифичностью, обусловленной амплификацией той или иной копии клеточных РНК, которые к тому же могли быть по-разному модифицированы в результате процессинга. Локализация ретро-позонов, внедрившихся в отдельные сайты генома у предков млекопитающих, может, по крайней мере, частично сохраняться в процессе дальнейшей эволюции. Например, места локализации Alu-подобного семейства в межгенных промежутках кластера глобиновых генов оказались достаточно сходными у мышей и приматов. [53]

Геном млекопитающих содержит несколько разных семейств коротких повторов. Короткие повторы у птиц и амфибий изучены значительно хуже. Число копий коротких повторов, например наиболее изученных повторов Alu-семейства у человека, составляет 3 - Ю5, что соответствует 5 - 6 % массы ДНК клетки. Такие повторы рассеяны по геному и получили название вездесущих. Нук-леотидная последовательность Alu-повтора гомологична последовательности отдельных участков 7S РНК - Структура 7S РНК достаточно консервативна у позвоночных, а гомологии в нуклеотидной последовательности прослеживаются и с 7S РНК насекомых. Поэтому семейства коротких повторов, присутствующие у разных видов, предшественником которых служила 7S РНК, также могут обладать достаточной гомологией. В то же время семейства коротких повторов, как и длинных, характеризуются видоспецифичностью, обусловленной амплификацией той или иной копии клеточных РНК, которые к тому же могли быть по-разному модифицированы в результате процессинга. Локализация ретро-позонов, внедрившихся в отдельные сайты генома у предков млекопитающих, может, по крайней мере, частично сохраняться в процессе дальнейшей эволюции. Например, места локализации Alu-подобного семейства в межгенных промежутках кластера глобиновых генов оказались достаточно сходными у мышей и приматов. [54]

Огромным достоинством гибридизационного анализа является возможность резко повысить его чувствительность, используя способность нуклеиновых кислот к самокопированию, приводящему к существенному увеличению числа анализируемых молекул. Этот прием известен под названием амплификации. Если речь идет об определении нуклеиновой кислоты известного строения, то содержание фрагмента этой ДНК длиной в несколько сотен пар нуклеотидов в исследуемом образце можно резко увеличить с помощью ДНК-жшимеразы. С этой целью к образцу добавляют синтетические праймеры, комплементарные 3 -концам, обеих нитей амплифицируемого участка ДНК, выбранных для репликации. В такой системе в присутствии дезоксинуклеозид-5 - трифосфатов и ДНК-полимеразы происходит репликация ДНК, причем именно той, для которой выбраны праймеры. В результате репликации появляются две новые копии с выбранными праймерами на 5 -концах. Процесс может быть продолжен, для чего необходимо расплавить сформировавшийся дуплекс и добавить новую порцию праймера, если он исчерпался. Последующее снижение температуры до уровня, позволяющего образование дуплекса матрица - праймер, позволяет осуществить следующий цикл репликации. Легко подсчитать, что теоретически достаточно 20 циклов, чтобы достичь увеличения количества ДНК в 106 раз. Так как ДНК-полимераза при нагревании может инактивироваться, то предпочтительно использовать специальные ферменты из термофильных организмов. В этом случае фермент выдерживает нагревание вплоть до температуры плавления и нет необходимости добавлять новые порции фермента после каждого цикла амплификации. Описанную процедуру называют цепной полимераэной реакцией или сокращенно ПЦР ( от англ. Она позволяет повысить в миллионы раз чувствительность, открывая таким образом возможность детектирования небольшого числа полинуклеотидных цепей, например несколько частиц вируса СПИДа в исследуемой крови. Гибридизационный анализ образцов, предварительно амплифицированных с помощью ПЦР, открывает перспективу ранней пренатальной диагностики наличия дефектного гена у плода, используя в качестве анализируемого материала небольшое число клеток околоплодной жидкости. На рис. 74 представлена принципиальная схема нескольких первых стадий процесса амплификации. Аналогичным образом можно анализировать РНК, если предварительно провести обратную транскрипцию. [56]

Страницы: 1 2 3 4