Cтраница 4
Наружная мембрана плотно прилегает к муреиновому слою и связана с ним липопротеинами. Муреиновый слой, видимо, свободно проницаем для различных веществ. Промежуток между муреином и плазматической мембраной называют периплазматическим пространством. В нем находятся белки, в том числе деполимеразы ( протеи-назы, нуклеазы), периферические белки плазматической мембраны и так называемые связующие белки. Последние участвуют в переносе некоторых субстратов в цитоплазму и служат рецепторами хемотаксических стимулов. Периплазматическое пространство, по всей вероятности, играет также роль в осморегуляции. [46]
Основное количество ферментов содержится в плотной части сока. Энтерокиназа и сахараза в соке толстой кишки отсутствуют. Щелочная фосфатаза содержится в концентрации в 15 - 20 раз меньшей, чем в тонкой кишке. В небольшом количестве присутствуют катепсин, пептидазы, липаза, амилаза и нуклеазы. [47]
При получении ферментного белка его легче извлечь из цитоплазмы, где он находится в растворимом состоянии, но весьма важно уметь выделять его из структурных образований клетки ( ядра, оболочки, митохондрии, микросомы и др.), в которых он бывает более или менее прочно фиксирован. Предварительное отделение структурных элементов облегчает получение растворимых ферментных белков, находящихся в цитоплазме. Чтобы извлечь структурно-связанные ферменты, нужно либо получить из клеток их комплексы ( с балластными веществами) и затем разрушить, либо разрушить комплекс в клетке с тем, чтобы в растворе иметь только сами ферменты. Обычно ферменты освобождаются из комплексов химическим воздействием, как обработкой бутанолом, растворами детергентов, как например, холата и дезоксихолата, натрийдоцедилсульфата, твина, эмазола и др. Весьма эффективно применять для этой цели гидролитические ферменты, как например, липазы, нуклеазы или протеолити-ческие. В последнем случае надо иметь в виду, что выделяемый из комплекса ферментный белок может быть частично или полностью расщеплен вместе с балластными белками, от которых стремятся избавиться. [48]
В-третьих, многие компоненты обладают очень низкой устойчивостью. Часто задача состоит в том, чтобы выделить тот или иной биополимер в нативном, т.е. сохраняющем биологическую активность, состоянии. Между тем многие белки и высокополимерные нуклеиновые кислоты при умеренных температурах и незначительных изменениях рН среды подвержены необратимому изменению конформа-ции - денатурации, которая обычно сопровождается потерей биологической активности - инактивацией. Кроме того, в клетках часто находятся ферменты, способные разрушать те или иные вещества. В первую очередь это относится к белкам и нуклеиновым кислотам, так как клетки обычно содержат ферменты, способные катализировать гидролиз этих биополимеров, - протеазы и нуклеазы. В неповрежденных клетках эти ферменты преимущественно сосредоточены в специальных гранулах - лизосомах. Однако при разрушении клеток или тканей, которое всегда предшествует началу работ по выделению интересующих исследователя веществ, лизосомы обычно разрушаются, ферменты выходят наружу, что приводит к быстрому разрушению биополимеров уже в исходной биомассе. [49]
Некоторые нуклеазы применяют для лечения вирусных заболеваний. Вирусные нуклеиновые кислоты в составе инфицированных клеток, особенно в период интенсивной репликации, транскрипции, биосинтеза вирусных белков, более доступны действию нуклеаз, чем нуклеиновые кислоты клетки, находящиеся преимущественно в виде комплексов с белками. Например, панкреатическая РНКаза применяется для лечения такого тяжелого заболевания, как клещевой энцефалит. Вследствие сравнительно небольших размеров этих ферментов они не вызывают сильного иммунного ответа, что позволяет использовать сравнительно дешевые препараты, добываемые из поджелудочных желез крупного рогатого скота на мясокомбинатах. Аналогичное применение нашли нуклеазы и в борьбе с вирусами, поражающими животных. Например, эндонуклеаза из микроорганизма Serratia marcescens оказалась эффективной против вирусного паралича пчел, приносящего большой ущерб пчеловодству. [50]
В процессе определения молекулярного веса необходимо предохранять препараты ДНК от случайной деградации. Например, образцы с молекулярным весом более 20000000 могут деградировать под действием гидродинамических сил во время таких операций, как отсасывание растворов пипеткой пли шприцем и фильтро-г. ДНК с любым размером молекул подвержены случайной денатурации. Например, полное удаленно противононов может привести к денатурации ДНК уже при комнатной температуре. Поэтому но следует растворять препараты ДНК в воде или подвергать их диализу против воды. Необходимо, конечно, предохранять растворы ДНК от микроорганизмов, так как многие из них могут выделять нуклеазы. ДНК рекомендуется хранить над хлороформом или толуолом. [51]
Объяснение всему этому может быть, по-видимому, только одно. Описанный ритуал - не что иное, как проверка ДНК на целостность сахаро-фосфатной цепи, своеобразный ОТК для ДНК. В самом деле, не следует забывать, что ДНК в клетке постоянно повреждается - облучением, химическими агентами, собственными нуклеазами, тепловым движением в конце концов. В главе 3 мы рассказывали о том, как эта репарирующая система залечивает повреждения, наносимые ультрафиолетовыми лучами. Репарирующая система располагает множеством ферментов. Одни, нуклеазы, рвут нить ДНК вблизи поврежденного нуклеотида. Другие ферменты расширяют брешь, удаляя поврежденное звено. Однако генетическая информация при этом сохраняется - ведь есть вторая, комплементарная нить, по которой ДНК-полимераза Корнберга вновь наращивает расщепленную цепочку. [52]