Cтраница 3
Элюцию ступенчатым или непрерывным градиентом осуществляют чаще всего за счет изменения концентрации соли в буфере неизменного состава. Изменение рН буфера используют, как правило, для ступенчатого градиента с целью нейтрализации, а иногда и изменения знака заряда компонентов фракционируемой смеси или нейтрализации самого обменника. В силу этого объем препарата роли не играет и может быть значительным. Загрузка не должна превышать 5 - 10 % от фактической емкости колонки для данного вещества. [31]
Вообще для группового разделения удобны короткие ( 20 - 30 см), а для фракционирования - более длинные ( до 100 см) хроматографические колонки. При аналитической гель-хроматографии объем наносимого препарата должен быть небольшим, но все же не менее 0 02 объема геля. При препаративной гель-хроматографии стараются наносить тот максимальный объем образца, при котором еще достигается требуемая степень разделения. [32]
Превращаясь в жидкость, реактив теряет первоначальный товарный вид, вместо кристаллов или порошкообразного продукта образуется большей частью слегка окрашенная жидкость. При последующем охлаждении жидкость затвердевает, образуя, как правило, сплошную кристаллическую массу. Так как затвердевание в большинстве случаев сопровождается увеличением объема препарата ( по сравнению с первоначальным объемом жидкости), то стеклянная тара, в которую расфасован реактив, может растрескаться. [33]
Метод гель-фильтрации в тонком слое ( ТСГФ) имеет ряд преимуществ перед колоночной хроматографией. Во-первых, на стартовую линию пластинки шириной, например, 20 см можно нанести 10 - 15 препаратов в виде пятен диаметром 3 - 5 мм, что позволяет сопоставлять результаты фракционирования многих препаратов в одном опыте, в идентичных условиях. Во-вторых, благодаря малой толщине слоя геля ( 0 4 - 1 мм) объем препарата может быть уменьшен до 5 - 20 мкл. Нет проблем и с обеспечением ровного слоя препарата - он мигрирует в виде пятна, как обычно при ТСХ. Наконец, нет необходимости ожидать, пока все компоненты фракционируемой смеси один за другим достигнут конца пластинки. Процесс разделения прекращают, как только наиболее быстрый компонент приблизится к нижнему краю геля. [34]
Для правильного проведения относительных измерений радиоактивности исследуемых препаратов необходимо соблюдать ряд условий. Форма препаратов и их размеры ( площадь, толщина) должны быть одинаковы. Препараты нужно одинаково располагать относительно счетчика. Радиоактивное вещество должно равномерно распределяться по всему объему препарата. Перед измерением препарат высушивают до исчезновения признаков влаги или до постоянного веса. Подложки, на которые нанесены измеряемые препараты, должны быть из однородного материала и одинаковой толщины. Все измерения желательно проводить на одной и той же установке с одним и тем же счетчиком и одной и той же подставкой ( кассетой) для крепления образцов. Должна быть обеспечена одинаковая статистическая точность всех измерений. В процессе работы необходимо систематически контролировать воспроизводимость показаний прибора. [35]
Начинают с того, что спускают жидкость из колонки так, чтобы открылся ( но не начал обсыхать. Затем сливную трубку зажимают. Раствор препарата осторожно, чтобы не взмутить сорбент, заливают по стенке колонки, начиная от расстояния в 1 мм над поверхностью сорбента и постепенно вместе с уровнем раствора препарата продвигая кончик пипетки вверх по стенке. После того как весь объем препарата внесен в колонку, сливную трубку освобождают от зажима и дают слою препарата войти в сорбент до того момента, когда его поверхность снова обнажится. Так же, как описано, вносят объем элюента, равный объему препарата, а затем спускают его в сорбент. Такую промывку стенок колонки целесообразно повторить еще раз. После этого заливают ( так же) некий объем элюента ( на высоту 1 - 2 см) и вставляют верхнюю пробку с капельницей. Вместе с тем следует иметь в виду, что в слое свободного элюента над сорбентом происходит перемешивание градиента, поэтому в случае градиентной элюции высота этого слоя должна быть минимально необходимой. После того как внесение препарата и подготовка колонки закончены, можно присоединить резервуар или насос, открыть сливную трубку и начать элюцию. [36]
Начинают с того, что спускают жидкость из колонки так, чтобы открылся ( но не начал обсыхать. Затем сливную трубку зажимают. Раствор препарата осторожно, чтобы не взмутить сорбент, заливают по стенке колонки, начиная от расстояния в 1 мм над поверхностью сорбента и постепенно вместе с уровнем раствора препарата продвигая кончик пипетки вверх по стенке. После того как весь объем препарата внесен в колонку, сливную трубку освобождают от зажима и дают слою препарата войти в сорбент до того момента, когда его поверхность снова обнажится. Так же, как описано, вносят объем элюента, равный объему препарата, а затем спускают его в сорбент. Такую промывку стенок колонки целесообразно повторить еще раз. После этого заливают ( так же) некий объем элюента ( на высоту 1 - 2 см) и вставляют верхнюю пробку с капельницей. Вместе с тем следует иметь в виду, что в слое свободного элюента над сорбентом происходит перемешивание градиента, поэтому в случае градиентной элюции высота этого слоя должна быть минимально необходимой. После того как внесение препарата и подготовка колонки закончены, можно присоединить резервуар или насос, открыть сливную трубку и начать элюцию. [37]
В более сложном, автоматическом дозаторе CAMAG LINOMAT III ( рис. 151) использован другой принцип нанесения препарата. Между кончиком иглы гамильтоновского шприца и поверхностью пластинки остается небольшой зазор. Игла почти до самого конца располагается в центре трубки, по которой подается струя азота. По мере выдавливания жидкости из иглы ( механически, с заданной скоростью) струя газа сдувает ее на поверхность пластинки. Таким образом, наносится пятно очень малого диаметра или узкая полоска. В последнем случае столик с пластинкой перемещается с заданной скоростью. Длину полоски ( и интервал между ними) можно заранее выбрать - вплоть до 20 см. Объем препарата задается с точностью 0 05 мкл в интервале 0 5 - 500 мкл. Цифровой индикатор непрерывно указывает нанесенный объем. Для смены препарата можно быстро заменить один шприц другим. [38]