Cтраница 2
За последние годы стали, однако, известны данные, плохо согласующиеся с этой теорией. В своем первом сообщении Бертран2 высказал предположение, что действие оксидазы не может проявиться, если марганец заменен другими металлами. Однако Словцов3, Сарту4 и Исаев5 приготовили оксидазы, совершенно не содержащие марганца и не содержащие железа, действие которых тождественно с действием оксидаз Бертрана, содержащих марганец. Согласно Исаеву, активность оксидаз, не содержащих марганца, не повышается при прибавлении солей марганца. Розен - фельд6, Штеклин 7, Бах и Черняк8 установили далее, что пероксидазы, тесная связь которых с оксидазами несомненна, не содержат ни марганца, ни железа. В связи со всеми этими данными возникает вопрос, участвуют ли вообще указанные металлы в самом действии оксидазы. Экспериментальное решение этого вопроса встретило большие трудности, которые мне удалось обойти только путем применения описанного в предшествующем сообщении метода: мне удалось приготовить из грибов очень активные препараты оксидазы, совершенно не содержащие ни марганца, ни железа. [16]
Механизм действия оксидазы неизвестен, но, невидимому, почти все оксидазы ( например, цитохромные оксидазы) являются производными гемина. Так как системы Fe - Fe одновалентные, то вероятно, что при действии оксидазы четыре водородных атома или электрона переносятся по одному; особенности оксидаз таковы, что приблизительно уравнивают энергии этих четырех ступеней. [17]
Ввиду того что препарат оксидазы, применявшийся в описанном выше опыте, содержал не только тирозиназу, но и фенолазы, было исследовано влияние на него алюминиевых солей при окислении фенолов. Дальнейшие опыты показали, что безразлично, образовались ли первичные желтые продукты окисления при самопроизвольном окислении пирогаллола под действием оксидазы или под действием перекиси водорода. С другой стороны, соли алюминия не оказывают заметного влияния на поглощение кислорода пирогаллолом ни сами по себе, ни в присутствии кипяченой оксидазы, по крайней мере в первых стадиях окисления. Соли других металлов также ускоряют превращение желтых продуктов окисления, но в меньшей мере, чем соли алюминия. При превращении первичных продуктов окисления гидрохинона соли марганца значительно активнее, чем соли алюминия. [18]
В объяснении активирования кислорода Бертран присоединяется к теории Гоппе-Зейлера, по которой окисляемое вещество расщепляет молекулу кислорода на свободные атомы, присоединяет к себе один из них, образуя окись, в то время как другой, будучи настоящим активным кислородом, может производить всякие окисления. Бертран только несколько расширил эту теорию и, постулируя образование двуокиси марганца в качестве первого продукта окисления, он мог вывести и второй атом кислорода за скобку и превратить его в активный кислород. Это дало ему возможность подвести действие оксидазы под категорию каталитических процессов, при которых ничтожное количество активного вещества может произвести неограниченное превращение. [19]
Одновременно с этим Бах и Шода34 сделали важное наблюдение, что оксидазы ( оксигеназы) различного происхождения активируются перокси-дазами по отношению к гваяковой реакции, к выделению иода из йодистого калия или к окислению пирогаллола совершенно так же, как и перекись водорода и другие перекиси. Оказалось, что они содержат марганец, но несмотря на это не оказывают ни малейшего окислительного действия в отсутствии перекиси. Это было несовместимо со взглядами Бертрана на роль марганца при действии оксидазы, и поэтому возникал вопрос, являются ли вообще так называемые оксидазы однородными ферментами или смесями пероксидаз с соединениями, аналогичными перекисям. Опыты Шода и Баха35 с полной достоверностью доказали, что правильно именно последнее предположение. [20]
В первой реакции поглощается кислород, а во второй - выделяется двуокись углерода. Отношение энантиомеров аминокислот может быть определено путем измерения радиоактивности продукта ферментативной реакции, если использованные субстраты содержали радиоизотопы. Для этого о - или ь - 14С - аланин превращали в пировиноградную кислоту под действием оксидазы о-аминокислот ( ЕС 2.61.2) или под действием системы трансаминаза - L-глутаминовая кислота - пировиноградная кислота [ схема (8.15) ]; соотношение энантиомеров в аланине было определено путем измерения радиоактивности в образующемся пирувате. [21]
Из этих опытов вытекает, что присутствие соединений марганца и железа совершенно не является решающим для действия оксидазы. Этот результат, который доказывает неправильность взгляда Бертрана, вполне соответствует предложенной мною9 13 лет тому назад и сейчас многими принятой перекисной теории оксидаз. Уже тогда я подчеркивал, что окисление индиго кислородом воздуха в присутствии бензальдегида представляет собою модель действия оксидазы. Это, однако, вовсе не означает, что металлические соединения, имеющиеся в растительных и животных организмах, не оказывают никакого влияния на действие оксидазы. Как будет показано в следующем сообщении, они ускоряют дальнейшее превращение первичных продуктов окисления, что может косвенно ускорить действие оксидазы. [22]
Описанный выше раствор-сырец оксидазы обладает известными свойствами оксидазы в резко выраженной форме. Одна капля раствора моментально окрашивает гваяковую настойку в темпосиний цвет. Если прибавить 2 см3 раствора оксидазы к раствору пирогаллола, то смесь немедленно окрашивается в коричневый цвет, а по истечении двух часов начинается выделение кристаллов пурпурогалина. Так же энергично и действие оксидазы на гидрохинон. [23]
D-ги-стидин усваивается крысами, но не мышами. D-триптофан не может быть использован для поддержания азотистого равновесия у человека, тогда как у крысы рост может обеспечиваться обоими изомерами. D-Изомеры фенил-аланина, тирозина, гистидина и метионина деза минируются очищенной оксидазой D-аминокислот ( стр. D-Треонин и D-лизин не используются для роста и не подвергаются действию оксидазы D-аминокислот. [24]
Без преувеличения можно сказать, что не только фактическая основа учения об окислительных ферментах, но в значительной степени и теоретическое толкование находится уже в работах Шенбейна. Однако как ни велико число растений, в которых с достоверностью установлено присутствие оксидаз, существует множество растений, которые не обнаруживают реакции на оксидазы. В некоторых случаях восстановители могут быть удалены при помощи подходящих растворителей, и тогда действие оксидазы выявляется. [25]
Из этих опытов вытекает, что присутствие соединений марганца и железа совершенно не является решающим для действия оксидазы. Этот результат, который доказывает неправильность взгляда Бертрана, вполне соответствует предложенной мною9 13 лет тому назад и сейчас многими принятой перекисной теории оксидаз. Уже тогда я подчеркивал, что окисление индиго кислородом воздуха в присутствии бензальдегида представляет собою модель действия оксидазы. Это, однако, вовсе не означает, что металлические соединения, имеющиеся в растительных и животных организмах, не оказывают никакого влияния на действие оксидазы. Как будет показано в следующем сообщении, они ускоряют дальнейшее превращение первичных продуктов окисления, что может косвенно ускорить действие оксидазы. [26]
Из этих опытов вытекает, что при подходящем разбавлении азотистая кислота ведет себя при окислении пирогаллола в точности так же, как и оксидаза. Если принять во внимание только то количество кислорода, которое поглощается в течение 24 и 48 часов, то получается, что оно почти строго пропорционально квадратному корню из применявшегося количества азотистой кислоты; это соотношение характерно для действия ферментов. При окислении пирогаллола оксидазой эта пропорциональность выступает менее отчетливо. Если принять во внимание, что в обоих случаях получается тот же продукт окисления - пурпурогалин - и что наиболее существенные количественные опыты, иллюстрирующие действие оксидазы, были произведены с пирогаллолом, то a priori не исключено, что азотистая кислота или какое-то соединение, аналогичное нитрозил-серной кислоте, и является активным началом оксидазы. Само собой разумеется, что и в этом случае предложенная нами перекисная теория самопроизвольного окисления должна оставаться в силе. [27]
Это было достигнуто путем обработки бумажных хроматограмм препаратом оксидазы af - аминокислот. Последняя полностью разрушила лейцин, тогда как треонин остался неизмененным. Отсюда следует, что первый из них имеет - конфигурацию, а второй является / - формой. Однако этим методом не удалось установить пространственное строение а, - диаминомасляной кислоты ( 511), так как контрольные опыты показали, что d - форма этого соединения устойчива к действию оксидазы / - аминокислот. [28]
Биоэлектрокатализ открывает принципиально новые возможности в изучении действия биокатализаторов. Электрохимические методы позволяют выяснить тонкие детали молекулярных механизмов действия ферментов. Экспериментальное исследование зависимостей тока от потенциала, концентрации фермента, концентрации ионов водорода и субстратов с последующим анализом на основе теории электрохимической кинетики позволяет выявить механизм превращений субстрата в активном центре фермента. Например, исследование кинетики действия медьсодержащей оксидазы, иммобилизованной на электроде, показывает, что наиболее вероятный механизм действия активного центра включает стадию присоединения кислорода, быстрый равновесный перенос одного электрона, двух протонов и синхронный замедленный перенос двух электронов на лимитирующей стадии процесса. Кинетическое исследование с привлечением структурных данных дает представление о молекулярном механизме действия оксидазы. [29]
Из этих опытов вытекает, что присутствие соединений марганца и железа совершенно не является решающим для действия оксидазы. Этот результат, который доказывает неправильность взгляда Бертрана, вполне соответствует предложенной мною9 13 лет тому назад и сейчас многими принятой перекисной теории оксидаз. Уже тогда я подчеркивал, что окисление индиго кислородом воздуха в присутствии бензальдегида представляет собою модель действия оксидазы. Это, однако, вовсе не означает, что металлические соединения, имеющиеся в растительных и животных организмах, не оказывают никакого влияния на действие оксидазы. Как будет показано в следующем сообщении, они ускоряют дальнейшее превращение первичных продуктов окисления, что может косвенно ускорить действие оксидазы. [30]