Определение - нуклеотидная последовательность
Cтраница 2
До сих пор были рассмотрены различные подходы к определению нуклеотидных последовательностей. Разнообразие экспериментальных методик, которыми при этом пользовались, свидетельствует о большом интересе к этой области исследований. В данной главе будут описаны многие из этих методик. [16]
Международная программа, целью которой является построение генетической и физической карт генома человека и определение полной нуклеотидной последовательности ДНК. [17]
Как и в других обзорах на эту тему, описание методов разделения построено по традиционной схеме: от сравнительно простых соединений ( азотистых оснований, нуклеозидов и нуклео-тидов) к все более сложным - олигонуклеотидам и различным классам РНК и ДНК - В заключительных разделах основное внимание уделено использованию хроматографии и электрофореза при определении нуклеотидной последовательности и для разделения нуклеопротеидов. Как правило, вначале описываются методы хроматографии, а затем - электрофореза. Этот обзор не претендует на роль исчерпывающей монографии, он скорее дает оценку современному состоянию исследований в данной области, акцентируя внимание на достижениях последних нескольких лет. Во многих случаях приведены примеры использования конкретной методики с целью проиллюстрировать ее возможности. [18]
Методом исключения было найдено, что третья группа пятен связана с участком инициации синтетазы. При определении нуклеотидной последовательности этих фрагментов было использовано наблюдение, что при расщеплении старых препаратов РНК фага R17 интенсивность пятен, соответствующих участку инициации белка оболочки, уменьшалась, тогда как интенсивность пятен, соответствующих участкам инициации двух других белков, возрастала. Предположили, что это происходит вследствие разрушения участка инициации белка оболочки с одновременным повышением доступности участков инициации синтетазы и А-белка. [19]
Ясно, что наиболее надежным доказательством идентичности структур продукта и затравки явилось бы установление идентичности нуклеотидных последовательностей в молекулах этих соединений. Однако, поскольку определение нуклеотидных последовательностей длинных отрезков ДНК - все еще нерешенная экспериментальная задача, приходится полагаться на менее прямые способы доказательства. Корнбергом был разработан новый подход к этой проблеме - так называемый метод определения частот ближайших соседей. Метод ближайших соседей состоит в определении абсолютной частоты, с которой каждый из этих динуклеоти-дов встречается в исследуемом образце ДНК. [20]
Поэтому исходная молекула ДНК предварительно фрагментируется. Это позволяет после определения нуклеотидной последовательности соответствующих фрагментов реконструировать первичную структуру всей ДНК. [21]
Работа над реализацией программы Геном человека ( HGP, Human Genome Project) официально началась 1 октября 1990 г. в США и контролирует ее Министерство энергетики ( Department of Energy) совместно с Государственными институтами здоровья ( National Institutes of Health) США. Ее конечная цель состоит в определении нуклеотидной последовательности всего генома человека. [23]
На основании данных, полученных на первом этапе, синтезируют новый праймер, перекрывающийся с концом уже секвенированного участка, и используют его для определения нуклеотидной последовательности следующего участка клонированной ДНК. Эту процедуру повторяют до тех пор, пока не секвенируют весь сегмент. [24]
Другими словами, как сказано в одном из нормативных документов, то, что не является предопределенным, не может считаться очевидным. Тем не менее РТО США придерживается существующего подхода к патентованию генов и недавно отклонил по крайней мере одну заявку на том основании, что методы, которые использовались для определения нуклеотидной последовательности гена, были рутинными и очевидными. Патентные поверенные в свою очередь считают, что патентоспособность изобретения не зависит от того, каким образом оно было сделано, а определяется тем, соответствует ли оно условиям патентоспособности. Вопрос о том, является ли использование известного способа получения гена препятствием к признанию такого гена неочевидным, следует решать в судебном порядке. Поскольку РТО использует прецедентный подход к вынесению решений по биотехнологическим заявкам, по-видимому, не существует абсолютного стандарта для оценки соответствующих изобретений, и суды скорее будут играть интегративную роль при рассмотрении вопроса о патентоспособности генов. [25]
Так, обработка АЗ ф5ТЗ ф5 ЦЗ ф фосфомоноэстеразой дает соответствующий три-мер со свободной цис-гликольной группой. Повторение всего процесса с динуклеотидом дает гуанин и аденозин - З - фосфат. Кроме определения нуклеотидной последовательности, этот метод позволяет также отличать 3 - 5 -межну-клеотидную связь в динуклеотидах от 2 - 5 -связи, так как при его применении миграции фосфата не происходит. [26]
В настоящее время проводятся исследования первичных структур различных молекул ДНК. Известны полные нуклеотидные последовательности ДНК ряда вирусов и плазмид. Совсем недавно завершено определение нуклеотидных последовательностей геномов двух прокариотических организмов ( Haemophilias influenzae и Mycoplasma genitalum) и появились сообщения о расшифровке генома первого эукариотического организма - дрожжей. Близки к завершению аналогичные исследования генома E. Исследователи активно работают над полной расшифровкой генома человека. [27]
Считают, что кольцевая форма раскрывается под действием эндонуклеазы. Существование липких концов подтверждается не только определением нуклеотидных последовательностей. [29]
Основные трудности в определении последовательности оснований в рибосомной, информационной и вирусной РНК возникают вследствие большого размера их молекул. Длина цепей этих молекул колеблется от 1300 звеньев у РНК вируса-сателлита вируса некроза табака, 1500 звеньев у 16 S рибосомной РНК до 6000 и более звеньев у вирусных РНК. Если это сопоставить с примерно 75 звеньями у тРНК и 120 звеньями у 5S РНК, то становится ясно, что определение нуклеотидных последовательностей у таких больших молекул по сравнению с более короткими в 1О - 20 раз более трудоемко. Составление полных и точных нуклеотидных перечней на основании гидролиза высокомолекулярных РНК специфическими нуклеазами даже при помощи наиболее эффективного в настоящее время метода перекрывающихся последовательностей является сложнейшей задачей. [30]
Страницы: 1 2 3