Cтраница 3
Благодаря рестриктирующим эн-донуклеазам, многие из которых в настоящее время производятся фирмами и поступают в продажу, стало возможным целенаправленное разрезание и картирование хромосом; эти ферменты стали также необходимым инструментом при определении нуклеотидных последовательностей ДНК. [31]
Эта область биохимии развивается с головокружительной скоростью. Редко проходит месяц без того, чтобы в биохимии не появилось сообщения о каком-нибудь крупном достижении или открытии. За расшифровкой генетического кода в начале 60 - х годов последовала нескончаемая вереница захватывающих открытий и обобщений крупного масштаба. Среди них определение нуклеотидных последовательностей многих генов, искусственный синтез генов, соединение генов в новых сочетаниях, встраивание генов одних видов в клетки других видов и получение с помощью таких измененных клеток продуцентов многих новых белков, полезных для тех или иных целей. [32]
ДНК ( бактериофага фХ174); произошло это в 1977 г. Сэнгер и его коллеги разработали очень изящную процедуру-метод терминации цепей, или, как его еще называют, плюс-минуоьсистему. Независимо от них Алан Максам и Уолтер Гилберт из США предложили несколько другой подход, получивший название химического метода. В обоих подходах используются фрагменты, полученные при расщеплении исходной ДНК с помощью рестриктирую-щих эндонуклеаз. В дополнении 27 - 1 описаны принципы метода определения нуклеотидной последовательности, разработанного Максамом и Гилбертом. [33]
Они обеспечивают: 1) встраивание чужеродной ДНК в вектор; 2) вырезание клонированной последовательности из вектора. Другими словами, после встраивания фрагмента ДНК в определенный сайт этот фрагмент можно вырезать после клонирования той же самой рест-риктазой, поскольку на концах встроенной нук-леотидной последовательности имеются два аналогичных сайта рестрикции. Иногда исходный сайт рестрикции модифицируется, тогда вырезание клонированного фрагмента затрудняется. Вырезанный фрагмент ДНК можно встраивать в векторы, предназначенные для определения нуклеотидной последовательности ДНК, или в векторы, специально сконструированные для обеспечения высокого уровня экспрессии ( транскрипции и трансляции) клонированного гена. [34]
В большинстве случаев целью такого переноса является создание нового продукта или получение уже известного продукта в промышленных масштабах. I мы познакомим читателя с концепциями молекулярной биотехнологии и теми микроорганизмами, которые в ней используются, с основами молекулярной биологии и методологией рекомбинантных ДНК. Будут описаны такие методы, как химический синтез генов, полимеразная цепная реакция ( ПЦР), определение нуклеотидной последовательности ( секвенирование) ДНК. Помимо успешного клонирования нужного гена очень важно обеспечить его правильное функционирование в организме нового хозяина, поэтому мы остановимся также на способах оптимизации работы клонированных генов в про - и эукариотических системах. В целом материал, изложенный в первой части, служит фундаментом, который позволяет понять различные аспекты конкретных применений молекулярной биотехнологии. [35]
Термостабильная ДНК полимераза T. Кленовский фрагмент ДНК полимеразы I включает ддНТФ, и усредненное соотношение дНТФ / ддНТФ для этого фермента составляет 3000 раз. Другой фермент, выделенный из бактериофага Т7, и после определенной модификации названный секвеназой, характеризуется крайне низкой избирательностью по отношению к типу включаемых нуклеотидов, и для него усредненное соотношение дНТФ / ддНТФ составляет всего около 3, причем разброс по разным ддНТФ не очень значителен. Благодаря этим своим свойствам, ( а также некоторым другим не рассматриваемым здесь качествам), данный фермент весьма удобен для определения нуклеотидных последовательностей ДНК и широко используется. [36]
Полимеразная цепная реакция, проводимая с помощью специфических олигонуклеотидных праймеров и термостабильной ДНК полимеразы позволяет избирательно амплифицировать определенные участки ген % ма чуть ли не в миллиард раз. Сфера применения метода поли-меразной цепной реакции очень широка. После такой избирательной амплификации появляется возможность проводить дальнейшие анализы с этим фрагментом ДНК, не прибегая к дорогостоящему и трудоемкому методу молекулярного клонирования. Помимо исключительно научного применения для наработки определенных участков генома для их дальнейшего изучения этот метод используется в медицинских исследованиях при диагностике опасных инфекций, наследственной патологии, предрасположенности к отдельным заболеваниям, при выявлении точечных мутаций, а также при генетическом картировании, генетическом полиморфизме, клеточном я гуморальном ответе на заболевания и др. Кроме этого, использование термостабильной ДНК полимеразы для определения нуклеотидных последовательностей фрагментов ДНК ферментативным методом по Сэнгеру позволяет проводить секвени-рующие реакции при повышенной температуре, что снимает влияние вторичной структуры и дает возможность секвенирования GC-богатых участков. Используя специфические праймеры, возможно секвениро-вать отдельные участки ДНК, минуя этап клонирования. [37]
Если же периодат полностью удалить до проведения реакции элиминирования, то образуется смесь свободного основания и основания, все еще связанного гликозидной связью. В то же время при кислотной обработке этой смеси выделяется стехиометрическое количество свободного основания. Для реакции - элиминирования был предложен ряд аминов; некоторые из них перечислены в табл. 6.1. В таблице приведены также выходы на стадии элиминирования при действии аминов на олигонукле - отид или нуклеиновую кислоту, обработанную периодатом. Из таблицы следует, что эта реакция протекает наиболее полно в возможно более мягких условиях, если в качестве амина используют анилин. Хотя в случае олигонуклеотидов эффективными оказываются более жесткие условия, для определения нуклеотидной последовательности в высокомолекулярной РНК, например РНК вируса табачной мозаики, предпочтительны более мягкие условия. [38]