Cтраница 3
Гем расположен в углублении под прямым углом к поверхности. В миоглобине и гемоглобине темы расположены параллельно поверхности. Гем в цитохроме с прочно; Прикреплен к белковой цепи посредством; двух цистеиновых остатков и одного тистидино-вого. Кроме того, гем соединен с гистидином и метионином, которые являются лигандами, расположенными между плоскостями. Такая закрытая структура не может комплектоваться с мо леку лами малых размеров. Роль этого белка заключается в окислении или восстановлении других молекул в системах, обеспечивающих перенос энергии. [31]
Железосерные белки обычно входят в состав электрон-транспортных цепей. Было показано, что они также могут быть объектом исследования методом ЯМР. Например, методом ЯМР было-проведено сопоставление свойств двух таких белков - ферредок-сина и рубредоксина из Clostridium pasteurianum. Ферредоксин из этого источника содержит 6 - 8 атомов железа в молекуле и вступает в двухэлектронные реакции окисления и восстановления. Показано, что атомы серы восьми цистеиновых остатков связаны с железом одновременно с кислотнолабильной серой. Последующее изучение температурной зависимости спектров ЯМР показало, что возможно существование магнитной восприимчивости двух типов. Магнитная восприимчивость восстановленного ферредоксина подчиняется закону Кюри, тогда как магнитная восприимчивость окисленного ферредоксина увеличивается с повышением температуры. Отсюда был сделан вывод о наличии интенсивного антиферромагнитного взаимодействия между атомами железа. По-скольку и окисленный, и восстановленный ферредоксин парамагнитен, можно ожидать, что железосодержащие центры будут возмущать спектр протонного магнитного резонанса белка. В спектре ферредоксина имеется восемь резонансных сигналов, сильно сдвинутых в слабое поле, интенсивность которых, по данным сопоставления со стандартом, соответствует восьми протонам на моль белка. Температурная зависимость положений этих сигналов коррелирует с температурной зависимостью магнитной восприимчивости, так что сдвиги, вероятно, обусловлены контактным механизмом. [32]
Не так давно было идентифицировано еще одно соединение, служащее переносчиком электронов между X d и пиридиннуклеотидом. Сначала было обнаружено, что он участвует в другой важной биосинтетической системе реакций - превращении атмосферного азота в NH азотфиксирующими бактериями ( см. гл. Позже выяснилось, что сходные пигменты присутствуют у самых разнообразных анаэробных и фотосинтезирующих бактерий, у сине-зеленых и зеленых водорослей и в клетках высших растений. Он обладает характерным спектром поглощения с максимумом в области 390 ммк, который исчезает при химическом или фотохимическом восстановлении. Эти атомы железа, вероятно, связаны с таким же числом цистеиновых остатков белка. Кроме того, ферредоксин содержит такое же число отщепляемых кислотой атомов серы. Это либо неорганический сульфид, либо очень лабильные органические остатки, разлагающиеся с образованием H2S в кислой среде. Аминокислотный состав ферредоксина необычен: в нем нет таких аминокислот, как гистидин, метионин и триптофан. Хотя железо в молекуле ферредоксина может существовать как в двухвалентном, так и в трехвалентном состоянии, все же нельзя утверждать с уверенностью, что окислительно-восстановительные свойства этого белка ( известно, что ферредоксин - одно-электронный переносчик) связаны с изменением валентности иона железа. Мысль об участии ферредоксина в реакциях системы I возникла, когда выяснилось, что неизвестный растворимый фактор, требующийся для фотовосстановления НАДФ хлоропластами, может быть заменен бактериальным ферредоксином и что хлоропласты на свету могут катализировать восстановление ( обесцвечивание) бактериального ферредоксина. Тем не менее оба соединения имеют сходные низкие окислительно-восстановительные потенциалы. [33]
Фермент, катализирующий реакцию (XI.8) - глицеральдегидфосфат-дегидрогеназа ( ГАФД) - распространен чрезвычайно широко. Мышечная ГАФД связывает кофермент ( НАД) настолько прочно, что он не отделяется от фермента даже при повторной кристаллизации или при диализе. Для полного удаления кофермента применяют адсорбцию на колонке из активированного угля. При этом освобождается четыре молекулы НАД, так что для регенерации голофермента к апоферменту должны присоединиться четыре молекулы пиридиннуклеотида. В образовании этого комплекса, спектр поглощения которого отличается от спектра поглощения свободного кофермента, по-видимому, принимает участие такое же число цистеиновых остатков белка. [34]
Ферридоксин является негемовым железосодержащим ко-ферментом. Он участвует в таких сильно различающихся процессах, как метаболизм пировиноградной кислоты и фиксация азота. Ферридоксины содержат железо-серные группировки; они присоединены к белкам с низкой молекулярной массой и обладают сильным отрицательным окислительно-восстановительным потенциалом. Источником ферридоксинов могут служить многие зеленые растения, а также некоторые фотосинтезирую-щие и другие бактерии. В состав молекулы ферридоксинов входит от 4 до 7 атомов железа в зависимости от источника выделения ( например, ферридоксин, получаемый из Clostridia, содержит 7 атомов железа), которые, по-видимому, соединены с равным числом цистеиновых остатков белка. [35]
При этом получаются две фракции А и Б, каждая из которых подвергалась систематическому расщеплению с образованием пептидов. Последние были разделены при помощи метода бумажной хроматографии и другими методами; после установления их строения оказалось возможным определить последовательность аминокислот в каждой из двух цепей. Цепь А содержит 21, а цепь Б - 30 аминокислот. Гидролиз природного инсулина химотрипсином, экстрактом поджелудочной железы и кислотами, т.е. в условиях, в которых не разрушаются связи S-S, привел в дальнейшем к получению пептидов, в которых эти мостики сохраняются. Последние обеспечивают связь с цепью А при помощи двух цистеиновых остатков цепи А, тогда как два остальных цистеиновых остатка цепи А образуют меньший цикл. Кроме того, было установлено, что из шести амидных групп молекулы три принадлежат аспарагиновым, а три - глутаминовым остаткам. [36]
Применение динитрофенильных производных, введенных в практику Зангером [25] с целью идентификации и количественного определения концевых аминогрупп, позволяет получить ценные сведения о количестве открытых цепей в белке. В этом отношении полезными являются также е - аминогруппы лизина. Такой подход к проблеме структуры белка был облегчен широким применением новейших микрометодов: хроматографии на бумаге и силикагеле и ионофореза. Таким образом, оказывается, что одна из крупнейших проблем химии белка поддается изучению с помощью весьма простых и экономичных методов. Цепи в инсулине имеют различную длину, причем цепь с N-концевым фенилаланином ( цепь В) состоит из 30 остатков, а соответствующая глициновая цепь ( цепь А) - из 21 остатка. Цепь А не содержит лизина, гистидина, аргинина, треонина, фенилаланина и пролина; все эти компоненты входят в состав цепи В, в которой, в свою очередь, совсем нет изолейцина. Не наблюдается ни регулярного чередования аминокислот, ни тенденции к чередованию полярных и неполярных групп. В обеих цепях содержится шесть цистеиновых остатков, четыре из которых расположены врозь, а только что упомянутые два - рядом друг с другом; в молекуле нативного белка все они существуют в форме цистина, но какие из них расположены между пептидными цепями, а какие в самих пептидных цепях - неизвестно. Часть дикарбоновых кислот присутствует в виде амидов - четыре в цепи А и две в цепи В. [37]
Жизнеспособность эритроцита определяется двумя метаболическими путями: гликолизом и пентозофосфатным путем. Примерно 90 % глюкозы в эритроцитах распадается в процессе гликолиза и 10 % - в пентозофосфатном пути. Потребление кислорода зрелыми эритроцитами очень низкое, оно связано преимущественно с окислением гемоглобина в метгемоглобин. Образующийся в этой реакции супероксидный радикал обезвреживается ферментом супероксиддисмутазой. Энергия АТФ, образованная методом субстратного фосфорилирования в гликолизе, обеспечивает работу Na, К - АТФазы. Блокада гликолиза, сопровождаемая нарушением образования АТФ - источника энергии для Na, К - АТФ-азы - выравнивает трансмембранный потенциал и ведет к гибели эритроцита. Особенностью гликолиза в эритроцитах является наличие шунта, приводящего к образованию 2 3-бисфосфоглицерата - одного из регуляторов переноса кислорода. Он связывается с гемоглобином и уменьшает его сродство к кислороду. Таким образом облегчается освобождение кислорода из гемоглобина эритроцитов в тканях. Глюкоза активно превращается ( 10 %) через реакции пенто-зофосфатного пути. Образующийся при этом НАДФН используется в защитных восстановительных синтезах, например для восстановления глутатиона. Восстановленный глутатион необходим в эритроците для поддержания в восстановленной форме цистеиновых остатков белков; для процессов детоксикации; предохранения гемоглобина от окисления. При наследственных заболеваниях ( например, дефицит глюкозо-6 - фосфатдегидрогеназы), когда интенсивность превращений глюкозы через реакции пентозофосфатного пути снижена, наблюдаются патологический гемолиз и развитие анемии. [38]
Железосерные белки обычно входят в состав электрон-транспортных цепей. Было показано, что они также могут быть объектом исследования методом ЯМР. Например, методом ЯМР было-проведено сопоставление свойств двух таких белков - ферредок-сина и рубредоксина из Clostridium pasteurianum. Ферредоксин из этого источника содержит 6 - 8 атомов железа в молекуле и вступает в двухэлектронные реакции окисления и восстановления. Показано, что атомы серы восьми цистеиновых остатков связаны с железом одновременно с кислотнолабильной серой. Последующее изучение температурной зависимости спектров ЯМР показало, что возможно существование магнитной восприимчивости двух типов. Магнитная восприимчивость восстановленного ферредоксина подчиняется закону Кюри, тогда как магнитная восприимчивость окисленного ферредоксина увеличивается с повышением температуры. Отсюда был сделан вывод о наличии интенсивного антиферромагнитного взаимодействия между атомами железа. По-скольку и окисленный, и восстановленный ферредоксин парамагнитен, можно ожидать, что железосодержащие центры будут возмущать спектр протонного магнитного резонанса белка. В спектре ферредоксина имеется восемь резонансных сигналов, сильно сдвинутых в слабое поле, интенсивность которых, по данным сопоставления со стандартом, соответствует восьми протонам на моль белка. Температурная зависимость положений этих сигналов коррелирует с температурной зависимостью магнитной восприимчивости, так что сдвиги, вероятно, обусловлены контактным механизмом. Два протона каждой из этих метиленовых групп неэквивалентны, по-видимому, вследствие затруднения вращений, что приводит к несколько различным сверхтонким взаимодействиям для каждого из этих протонов. Другие восемь протонов, которые сдвинуты в меньшей степени, также удалось разрешить в спектре ЯМР и идентифицировать как протоны р-метиленовых групп остальных четырех цистеиновых остатков. Предполагается, что атомы серы этих цистеиновых остатков связаны только с одним атомом железа каждый, поэтому индуцированный атомом железа сдвиг меньше, чем для других цистеинов. [39]
Железосерные белки обычно входят в состав электрон-транспортных цепей. Было показано, что они также могут быть объектом исследования методом ЯМР. Например, методом ЯМР было-проведено сопоставление свойств двух таких белков - ферредок-сина и рубредоксина из Clostridium pasteurianum. Ферредоксин из этого источника содержит 6 - 8 атомов железа в молекуле и вступает в двухэлектронные реакции окисления и восстановления. Показано, что атомы серы восьми цистеиновых остатков связаны с железом одновременно с кислотнолабильной серой. Последующее изучение температурной зависимости спектров ЯМР показало, что возможно существование магнитной восприимчивости двух типов. Магнитная восприимчивость восстановленного ферредоксина подчиняется закону Кюри, тогда как магнитная восприимчивость окисленного ферредоксина увеличивается с повышением температуры. Отсюда был сделан вывод о наличии интенсивного антиферромагнитного взаимодействия между атомами железа. По-скольку и окисленный, и восстановленный ферредоксин парамагнитен, можно ожидать, что железосодержащие центры будут возмущать спектр протонного магнитного резонанса белка. В спектре ферредоксина имеется восемь резонансных сигналов, сильно сдвинутых в слабое поле, интенсивность которых, по данным сопоставления со стандартом, соответствует восьми протонам на моль белка. Температурная зависимость положений этих сигналов коррелирует с температурной зависимостью магнитной восприимчивости, так что сдвиги, вероятно, обусловлены контактным механизмом. Два протона каждой из этих метиленовых групп неэквивалентны, по-видимому, вследствие затруднения вращений, что приводит к несколько различным сверхтонким взаимодействиям для каждого из этих протонов. Другие восемь протонов, которые сдвинуты в меньшей степени, также удалось разрешить в спектре ЯМР и идентифицировать как протоны р-метиленовых групп остальных четырех цистеиновых остатков. Предполагается, что атомы серы этих цистеиновых остатков связаны только с одним атомом железа каждый, поэтому индуцированный атомом железа сдвиг меньше, чем для других цистеинов. [40]