Аминокислотный анализ
Cтраница 3
Цистеин также не реагирует с ОФА, однако после обычного при аминокислотном анализе предварительного окисления до цистеин-сульфокислоты ( см. ниже) окрашивание происходит. Там же приведена таблица относительных выходов флюоресценции для различных аминокислот. [31]
Для ряда эндо - ( - - 4) - р-глюканаз был проведен аминокислотный анализ [44, 64, 65], в результате которого установлено, что в некоторых ферментах преобладают аминокислоты основного характера, а в других - кислотного. Наличие полисахаридов, химически связанных с молекулой фермента, может обусловливать многообразие компонентов ( 1 - - 4) - р-глюка-назы, о котором было давно известно. Однако до настоящего времени не установлено связи между структурой ферментов и функцией полисахаридов. [32]
Несмотря на общий характер метода энантиомерной метки, разработан он был главным образом для аминокислотного анализа с помощью ГХ. [34]
Ионообменная хроматография на колонках применяется в трех очень важных областях: 1) для качественного и количественного аминокислотного анализа пептидов и белков, дающего ценную характеристику молекул; его можно использовать как средство обнаружения некоторых специфических различий среди белков; 2) для определения аминокислотного состава биологических жидкостей, который дает не только существенную информацию о наличии свободных аминокислот, но и позволяет проследить за изменениями, происходящими в организме под воздействием многих факторов, таких, как окружающая среда, физиологическое состояние и генетическая конституция; 3) для определения первичной структуры белков - чрезвычайно важной задачи биохимии сегодняшнего дня. Многие исследователи занимаются определением аминокислотной последовательности большого числа разнообразных белков. Это дает возможность установить их химическую структуру и изучить ее взаимосвязь с функцией. [35]
Кроме того, несмотря на кажущуюся с первого взгляда возможность использования методов, применяемых при аминокислотном анализе, последние для своего проведения обычно нуждаются в предварительном синтезе чистых контрольных соединений, что в случае пептидов связано с большой затратой труда. [36]
Получающиеся дипептиды можно разделить с помощью ионообменной хроматографии подобно тому, как это делают при аминокислотном анализе, однако при поточном расщеплении необходимо собирать фракции для дальнейшего анализа. [37]
В настоящее время метод газо-хроматографического разделения и анализа аминокислот не представляет еще законченного и универсального способа аминокислотного анализа белковых гидролизатов. Разработанные методики конверсии аминокислот в летучие производные, особенно количественной конверсии в N-ТФА-метиловые, и в значительной степени их успешное разделение на колонках с низким содержанием полиэфирных полярных стационарных фаз позволяют уже сейчас в ряде случаев использовать метод газо-жидкостной хроматографии для определения абсолютных количеств аминокислот в смесях. Но требуется дальнейшая доработка метода, и в особенности его аппаратурного оформления, прежде чем он займет должное место при изучении аминокислотного состава белков. [38]
Весьма часто аниониты используют для снижения кислотности или нейтрализации растворов органических веществ ( кислые гидролизаты белков при их аминокислотном анализе, гидролизаты казеина в пищевой промышленности и др.) - Сорбция ряда неионогенных органических веществ достигается путем их химического взаимодействия с поглощенными ионитом компонентами: кетонов и альдегидов - на анионитах в бисуль-фитной форме, углеводов - па анионитах в боратной форме и проч. [39]
Несмотря на то что некоторые вопросы количественного определения уже затрагивались, здесь будет рассмотрен ряд других аспектов этой проблемы в связи с тем, что цель аминокислотного анализа всегда состоит в определении молярного аминокислотного состава пептида. Если не учитывать определенных условий и ограничений, в ГХ особенно велика вероятность получения неверных количественных результатов. [40]
Введенные в последние годы современные микрометоды, базирующиеся на ряде новых принципов ( изотопное разбавление, выращивание бактерий, хроматография), привели к кардинальным успехам в области аминокислотного анализа, и многие белки сейчас проанализированы полностью. В настоящее время имеются веские основания считать, что точность некоторых новых методов так велика, что данные по аминокислотному составу можно использовать для получения сведений, имеющих важное значение в исследовании структуры белка. [41]
Конингсберг и Хилл ввели важное усовершенствование в этот метод, а именно хроматографическое разделение очищенного деградированного пептида, что открыло возможность идентификации отщепленной N-концевой аминокислоты путем сравнения результатов аминокислотного анализа исходного и деградированного пептида. [42]
При определении лейцинаминопептидазы и трипсина, ковалентно связанных с сефарозой, Келып и др. [41] сопоставили пять методов определения связанных белков: 1) основанный на балансе белка перед и после связывания; 2) аминокислотный анализ после кислотного гидролиза; 3) модифицированный метод Лоури; 4) спектрофотометрический и 5) флуориметрический. Преимущество двух последних методов, которые они исследовали детально, состоит в том, что эти методы не приводят к разрушению геля. Как и метод Лоури, они характеризуются простотой, низким пределом обнаружения и высокой воспроизводимостью. [43]
Утверждая, что результаты аминокислотного анализа являются неутешительными, Бейли [70] отразил точку зрения большинства исследователей, занимающихся анализом белков. Аминокислотный анализ представляет собой необходимую предварительную стадию всякого всестороннего исследования структуры и функции белков. Однако подобно другим аналитическим исследованиям аминокислотный анализ оказывается полезным только в сочетании с результатами других исследований. Химики, занимающиеся изучением белков, со времени Риттхаузена [68] ( 1872 г.) до Викери [69] ( 1946 г.) придерживались довольно естественной точки зрения о том, что знание аминокислотного состава даст возможность объяснить свойства белка, так как последние должны быть интегральной функцией входящих в их состав аминокислот. В настоящее время признано, что свойства боковых цепей белка не являются простыми функциями свойств свободных аминокислот, а представляют собой в действительности весьма сложные функции, зависящие от многих факторов, в частности от относительного расположения боковых цепей в главной пептидной цепи и в свернутой молекуле натив-ного белка. [44]
Аминокислотный анализ включает две главные стадии: гидролиз белка до аминокислот и количественное определение продуктов гидролиза. [45]
Страницы: 1 2 3 4