Полинуклеотидфосфорилаза
Cтраница 2
Для этой РНК наблюдалось также более редкое, чем обычно, увеличение скорости ферментативного гидролиза ( РНК-азой или полинуклеотидфосфорилазой) при повышении температуры. [16]
Например, полинуклеотид, содержащий только один тип оснований, может быть получен из нуклеотидов ( дифосфатов) и фермента, называемого полинуклеотидфосфорилазой, выделенного Очоа и Грюнберг-Манаго. Если основанием является урацил, синтетический полинуклеотид называется поли - У ( УУУУУУУ... В присутствии смеси молекул тРНК, ферментов и других компонентов клеток поли - У инициирует синтез полипептида, содержащего аминокислоты только одного вида - а именно полифенил ал а-нин. Таким образом, ясно, что триплет УУУ является кодоном для фенилаланина. [17]
В некоторых случаях возможна ферментативная полимеризация и в отсутствие добавляемого олиго - или полинуклеотида. Обычные препараты полинуклеотидфосфорилазы катализируют полимеризацию нуклеозиддифосфатов и без затравки или инициатора. Такая способность, однако, теряется при дальнейшей очистке фермента; она связана, очевидно, с присутствием олигонуклеотидов в малоочищенных ферментных препаратах. В некоторых условиях удается осуществить синтез полинуклеотидов без матрицы с ДНК - и РНК-полимеразами; эти случаи будут рассмотрены ниже. [18]
Дальнейшие успехи были достигнуты после того, как удалось вслед за гомополимерами ( гомополинуклеотидами) синтезировать гетерополиме-ры. В результате действия полинуклеотидфосфорилазы в этой смеси синтезируется смешанный полинуклеотид, содержащий Ц и Г в чисто случайной ( статистической) последовательности. [19]
В 1955 г. Очоа и Прюнберг-Манаго в бактериальных экстрактах из Azotolbacter vinelandii обнаружили фермент, катализирующий синтез РНК из рибонуклеозиддифосфатов. Этот фермент был назван полинуклеотидфосфорилаза. Для действия фермента необходимо наличие в реакционной среде некоторого количества затравки и ионов магния; при синтезе РНК освобождается неорганический фосфат. [20]
Как нуклеозид-5 - трифосфаты, так и нуклеозид-5 - пирофосфаты могут действовать как катализируемые ферментами фосфорилирую-щие агенты. Исключения могут быть найдены в реакциях полимеризации, катализируемых полинуклеотидфосфорилазой, где нуклео-фильная атака З - гидроксильной группы а-атома фосфора приводит к образованию полирибонуклеотидов. [21]
Аналогично полиадениловая кислота расщепляется диэстера-зой селезенки ( или рибонуклеазой Т2) до смеси аденозин - З - фосфата и устойчивых к ферменту олигонуклеотидов, содержащих исключительно 2 - 5 -межнуклеотидные связи. Синтетические гомопо-лимеры инициируют ферментативную полимеризацию нуклеозид-5 - пирофосфатов под действием полинуклеотидфосфорилазы. [22]
До сих пор остается не ясным, связаны ли ферментные системы с основным путем синтеза РНК in vivo. Если случайное распределение нуклеотидов, найденное у сополимеров, полученных с помощью Полинуклеотидфосфорилазы, и не дает повода возразить против такой функции, то вследствие низкого сродства к субстрату необходимы достаточно высокие локальные концентрации нукле-озид-5 - пирофосфатов. [23]
Последовательность мономеров в растущей полимерной цепи при этом не зависит от последовательности мономеров в добавленном олиго-или полинуклеотиде; добавленная затравка входит в состав продукта реакции, составляя его 5 -концевую последовательность. Такая функция олиго - или полинуклеотида наблюдается для реакций, катализируемых терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой и полинуклеотидфосфорилазой. [24]
Механизм синтеза РНК в растениях in vivo не установлен. Свойства РНК-полимеразы позволяют полагать, что этот фермент участвует в синтезе по крайней мере какой-то части клеточной РНК - Роль полинуклеотидфосфорилазы неясна. Отсутствие способов для точного копирования и ограниченное распространение полинуклеотидфосфорилазы ( очевидно, она отсутствует у животных и некоторых растений) свидетельствуют против участия этого фермента в синтезе РНК - Возможно, что основная его функция заключается в расщеплении РНК. [25]
 |
Некоторые ферментативные реакции переноса фосфорила и нуклеотидила, включающие нуклеозидполифосфатные эфиры 40а. [26] |
В переносе нуклеотидила могут участвовать нуклеозидполифосфатные эфиры, отличные от АТР. Например, РНК - и ДНК-по-лимеразы катализируют нуклеотидильный перенос с обычных рибо - и дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, в то время как реакция полимеризации, катализируемая полинуклеотидфосфорилазой, является примером ферментативной реакции, в которой нуклеоти-дильные остатки переносятся с рибонуклеозид-5 - пирофосфатов. Биосинтез нуклеозиддифосфатосахаров осуществляется ферментами нуклеотидильного переноса. [27]
РНК-полимераза требует для транскрипции в качестве предшественников нуклеозид-5 - трифос-фаты, а с нуклеозид-5 - дифосфатами она не работает. Полинуклеотидфосфорилаза, наоборот, требует нуклеозид-5 - дифос-фаты, а с 5 -трифосфатами она не работает. [28]
Позднее подобные ферменты были выделены из ряда других источников. Полимерный продукт РНК-полимеразной реакции химически идентичен природной РНК. ДНК-полимеразой и полинуклеотидфосфорилазой, в заметной степени обратима и нуждается в присутствии ионов двухвалентного металла, обычно магния. Для РНК-полимеразной реакции необходимо присутствие всех четырех рибонуклеозидтрифосфатов. Особенно интересна потребность в ДНК-затравке. Естественно, возникает вопрос о соотношении между структурами ДНК-затравки и РНК-продукта. Ниже приводятся экспериментальные факты, четко подтверждающие матричную роль ДНК-затравки в синтезе РНК, а также тот факт, что нуклеотидная последовательность в ДНК-затравке точно транскрибируется в комплементарную нуклеотидную последовательность РНК. [29]
Единственным исключением служат РНК-синте-тазы, которые значительно более эффективно используют в качестве матрицы РНК соответствующих фагов. Для терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы затравкой могут служить как полидезоксинуклеотиды, так и олигодезоксинуклеотиды, начиная с тринуклеозиддифосфата. Эффективными затравками реакции, катализируемой полинуклеотидфосфорилазой, являются низкомолекулярные олигорибонуклеотиды, в том числе динуклеозидмонофос-фаты. В реакции, катализируемой ДНК-полимеразой, в качестве матрицы могут выступать полидезоксинуклеотиды и некоторые по-лирибонуклеотиды. Однако полимеризация происходит и в присутствии коротких олигодезоксинуклеотидов. Очень медленная полимеризация наблюдается уже с тринуклеозиддифосфатами, заметно больше скорость реакции с гепта - декадезоксинуклеотидами. РНК-полимеразы из микроорганизмов могут использовать в качестве матрицы одно - и двухцепочечные полидезоксирибонуклеотиды и полирибонуклеотиды, а также олигодезоксирибонуклеотиды со степенью полимеризации 5 и выше и олигорибонуклеотиды приблизительно такого же размера. [30]
Страницы: 1 2 3