Cтраница 3
Механизм синтеза РНК в растениях in vivo не установлен. Свойства РНК-полимеразы позволяют полагать, что этот фермент участвует в синтезе по крайней мере какой-то части клеточной РНК - Роль полинуклеотидфосфорилазы неясна. Отсутствие способов для точного копирования и ограниченное распространение полинуклеотидфосфорилазы ( очевидно, она отсутствует у животных и некоторых растений) свидетельствуют против участия этого фермента в синтезе РНК - Возможно, что основная его функция заключается в расщеплении РНК. [31]
Некоторые олигонуклеотиды наиболее удобно получать расщеплением соответствующих полимеров. Это относится к гомогенным олигорибонуклеотидам. Xp) nYp, которые легко получить, расщепляя продукт полимеризации ррХ и ppY ( под действием полинуклеотидфосфорилазы) нуклеазой, специфичной к остатку Yp. [32]
Рибонуклеиновая кислота расщепляется под действием высокоспецифичного фермента ри б о ну клеазы. Этот фермент расщепляет РНК а мононуклеотиды. При изучении путей синтеза РНК мы видели, что он может идти при участии двух ферментов - тюлинуклеогидфосфорилазы и РНК-нуклеотидилтранс-феразы. В настоящее время считают, что действие этих ферментов обратимо и что с их участием может происходить также и распад РНК - Однако, в отличие от рибонуклеазы, при действии полинуклеотидфосфорилазы образуются нуклеозиддифос-фаты, а при действии РНК-нуклеотидилтрансферазы - соответ-ветствующие нуклеозидтрифосфаты. [33]
Равновесие достигается при освобождении 70 % ортофосфата. Введение полинуклеотидфосфори-лазы в эту систему приводит к расщеплению полимера по фос-фоэфирньш связям и образованию нуклеозид-5 - дифосфатов в количестве, определяемом условиями равновесия. Эта реакция аналогична обратимой реакции синтеза полисахаридов из глю-козо-1 - фосфата, катализируемой ферментом фосфорилазой. По этой причине фермент системы Очоа и называют полинуклеотид-фосфорилазой. В системе могут использоваться различные мономерные единицы. Полинуклеотидфосфорилаза вначале была найдена в бактериях, а затем обнаружена также в растениях и животных. Полинуклеотидфосфорилаза отличается от фермента, синтезирующего ДНК, тем, что она осуществляет синтез из дифосфатов, а не из трифосфатов нуклеозидов, и тем, что синтезированный с ее помощью продукт отражает скорее соотношение мономерных единиц в системе, чем состав затравки. Совсем недавно был открыт фермент, который катализирует синтез РНК из рибонуклеозидтрифосфатов. Система с этим ферментом очень напоминает систему с ДНК-полимеразой, вплоть до того, что для осуществления синтеза требуется присутствие ДНК в качестве затравки. РНК, синтезированная в такой системе, имеет тот же нуклеотидный состав и ту же частоту ближайших соседей, что и использованная в качестве затравки ДНК. Системы такого рода будут более подробно рассмотрены в разд. [34]
Равновесие достигается при освобождении 70 % ортофосфата. Введение полинуклеотидфосфори-лазы в эту систему приводит к расщеплению полимера по фос-фоэфирньш связям и образованию нуклеозид-5 - дифосфатов в количестве, определяемом условиями равновесия. Эта реакция аналогична обратимой реакции синтеза полисахаридов из глю-козо-1 - фосфата, катализируемой ферментом фосфорилазой. По этой причине фермент системы Очоа и называют полинуклеотид-фосфорилазой. В системе могут использоваться различные мономерные единицы. Полинуклеотидфосфорилаза вначале была найдена в бактериях, а затем обнаружена также в растениях и животных. Полинуклеотидфосфорилаза отличается от фермента, синтезирующего ДНК, тем, что она осуществляет синтез из дифосфатов, а не из трифосфатов нуклеозидов, и тем, что синтезированный с ее помощью продукт отражает скорее соотношение мономерных единиц в системе, чем состав затравки. Совсем недавно был открыт фермент, который катализирует синтез РНК из рибонуклеозидтрифосфатов. Система с этим ферментом очень напоминает систему с ДНК-полимеразой, вплоть до того, что для осуществления синтеза требуется присутствие ДНК в качестве затравки. РНК, синтезированная в такой системе, имеет тот же нуклеотидный состав и ту же частоту ближайших соседей, что и использованная в качестве затравки ДНК. Системы такого рода будут более подробно рассмотрены в разд. [35]
Имеются экспериментальные данные ( см. стр. В реакции, найденной 0чоа и Грин-берг - Манаго, этот механизм не отражен. Правда, было показано, что в некоторых случаях, когда поликонденсация идет медленно с большим периодом индукции ( например, для гуано зиндифос-фата) затравка из небольшого полинуклеотида ( например, тримера) ускоряет реакцию и помогает преодолеть период индукции; однако это явление еще очень далеко от репликации РНК, наблюдаемой в природе. Цепь полинуклеотида, образующегося, если смешать все 4 мономера, абсолютно не упорядочена, как в любом синтетическом полимере. Тринуклеотид затравки оказывается химически связанным в начале цепи, как обычный инициатор. Если реакция, катализируемая ферментом полинуклеотидфосфорилазой имеет какое-либо значение в природе, то она должна приводить к какой-то неспецифической РНК, не связанной с передачей генетической информации. Возможно, что в клетке содержится наряду с другой и подобная РНК. [36]
В случае высокоочищенных ферментных препаратов полимеризация происходит лишь после индукционного периода, которого, однако, можно избежать при добавлении небольшого количества полину-клеотидиой или олигонуклеотидной затравки ( природной, а также синтезированной ферментативным или химическим путем), включая даже динуклеотиды. Полимерные цепи образуются в результате последовательного присоединения мононуклеотидов к неэтерифици-рованной З - гидроксильной группе концевого нуклеозидного остатка; затравки, содержащие свободную З - гидроксильную группу, такие, как ф5 АЗ ф5 А или АЗ ф5 У, при этом включаются в поли-нуклеотид. Полимеризация гуанозин-5 - пирофосфата требует обязательного наличия такой затравки. При этом индукционного периода не наблюдается, хотя эти олигонуклеотиды не включаются в конечный полимерный продукт. При действии ферментов в противоположном направлении полинуклеотиды легко фосфоролизируются с образованием нуклео-зид-5 - пирофосфатов. Так, ферментативно синтезированные гомополимеры быстро фосфоролизируются так же, как и небольшие олигонуклеотиды, содержащие концевой 5 -фосфат, в то время как фосфоролиз олигонуклеотидов ( вплоть до пентануклеотидов) с концевой З - фос-фатной группой не идет. Как и в случае синтеза, реакция фосфоролиза идет ступенчато ( начиная от конца, несущего неэтерифициро-ванную З - гидроксильную группу), причем конечным продуктом являются нуклеозид-5 - пирофосфаты и концевой динуклеотид. Фосфоролиз многотяжных цепей ( таких, как смесь полиадениловой и полиуридиловой кислот) и сополимеров в значительной степени затруднен. Относительное увеличение скорости фосфоролиза препаратов рибонуклеиновых кислот при повышении температуры связано с температурным гиперхромным эффектом полинуклеоти-дов. Поскольку этот тип гиперхромного эффекта может рассматриваться как результат ( косвенный) расщепления водородных связей, фосфоролиз, таким образом, зависит в значительной степени от конформации полинуклеотида и, в особенности, от количества водородных связей. Оказалось также, что полинуклеотидфосфорилаза катализирует перенос нуклеозидмонофосфатных единиц от поли-нуклеотида-донора к другому акцепторному полинуклеотиду. [37]