Cтраница 2
Строение молекулы инсулина было раскрыто главным образом благодаря упорным исследованиям английского биохимика Зангера и небольшой группы сотрудников Кембриджского университета. В течение 10 лет Зангер интенсивно изучал одну эту молекулу. [16]
Потери, которые имеют место при гидролизе свободных ДНФ-амино-кислот, обнаружили Портер и Зангер, но практика показала, что для ДНФ-аминокислот, связанных в пептидную цепочку, эти потери еще больше. Для определения этих нестойких ДНФ-аминокислот применяется следующий специальный метод. [17]
Для получения ДНФ-аминокислот, необходимых в качестве стандартов, приводим основные ссылки на первоисточники: Абдерхальден и Блумберг, Зангер [1], Портер и Зангер. Очень хороший метод рекомендуют Леви и Чунг 13 ]: динитрофенилировапие проводится в водном растворе. Синтез редко встречающихся ДНФ-амипокислот описали Рамачандран и Мак-Конпел 12 ], Рао и Собер. [18]
Преимущество фтора в качестве замещаемой группы по сравнению с более тяжелыми галогенами привело к тому, что именно 2 4-динитрофторбен-зол ( реагент Зангера) находит применение как специфическое средство для характеристики первичных и вторичных аминов. Особенно широкое применение находит этот реагент для пометки концевых единиц в молекуле белков и полипептидов ( гл. Пептид обрабатывают реагентом Зангера и в образующемся веществе под действием гидролиза расщепляются амидные связи, соединяющие аминокислотные единицы в данном пептиде. Выделение и идентификация этого аминокислотного фрагмента, несущего динитрофениль-щю группу, выявляет концевую единицу данного пептида. [19]
Преимущество фтора в качестве замещаемой группы по сравнению с более тяжелыми галогенами привело к тому, что именно 2 4-динитрофторбен-зол ( реагент Зангера) находит применение как специфическое средство для характеристики первичных и вторичных аминов. Особенно широкое применение находит этот реагент для пометки концевых единиц в молекуле белков и полипептидов ( гл. Пептид обрабатывают реагентом Зангера и в образующемся веществе под действием гидролиза расщепляются амидные связи, соединяющие аминокислотные единицы в данном пептиде. Выделение и идентификация этого аминокислотного фрагмента, несущего динитрофениль-ную группу, выявляет концевую единицу данного пептида. [20]
Для получения ДНФ-аминокислот, необходимых в качестве стандартов, приводим основные ссылки на первоисточники: Абдерхальден и Блумберг, Зангер [1], Портер и Зангер. Очень хороший метод рекомендуют Леви и Чунг 13 ]: динитрофенилировапие проводится в водном растворе. Синтез редко встречающихся ДНФ-амипокислот описали Рамачандран и Мак-Конпел 12 ], Рао и Собер. [21]
Примерно через год интенсивной работы Зангеру и Туппи удалось собрать обломки и описать строение фенилаланиновой цепи инсулина. Затем Зангер занялся глициновой цепью и еще год совместно с автором данной статьи выяснял ее строение. [22]
Шелленберг [144] использует вариант известной флуоресцентной пробы с морином. Флуоресцентный метод Зангера и Туппи [95] в отсутствие целлюлозы кажется нам несколько неточным. [23]
Другим методом, сыгравшим очень важную роль в решении инсулиновой головоломки, был метод распределительной хроматографии, предложенный для разделения аминокислот и пептидов химиками А. Естественно, что Зангер должен был разделять и определять вещества в исключительно малых количествах материала. С помощью хроматографии на бумаге можно со значительной точностью анализировать количество смеси, равное одной миллионной доле грамма. [24]
Колориметрический метод количественного определения мышьяка применяется при малых количествах последнего, равных 0 001 - 0 01 мг. Метод основан на реакции Зангер - Блека. [25]
Строение молекулы инсулина было раскрыто главным образом благодаря упорным исследованиям английского биохимика Зангера и небольшой группы сотрудников Кембриджского университета. В течение 10 лет Зангер интенсивно изучал одну эту молекулу. [26]
Зангеру удалось далее расщепить каждую цепь на части и изучить обломки - особенно те, которые частично перекрывали друг друга, - что дало ему возможность выяснить последовательность расположения аминокислот. Сосредоточив внимание на начале глициновой цепи, Зангер пометил глицин ДНФ и изучил обломки пептидов, полученные при частичном гидролизе. В обломках разрушенных глициновых цепей он обнаружил такую последовательность молекул: глицин - изо-лейцин; глицин - изолейцин - валин; глицин - изолей-цин - валин - глутаминовая кислота; глицин - изолейцин - валин - глутаминовая кислота - глутаминовая кислота. Так было выяснено, что первые пять аминокислот в глициновой цепи - это глицин, изолейцин, валин и две молекулы глутаминовой кислоты. Этим же способом была установлена последовательность первых четырех аминокислот в фенилаланиновой цепи: фенил-аланин, валин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты. [27]
Пометка ДНФ-группами и последующий полный гидролиз доказали, что фрагмент с молекулярным весом 6000 включает одну молекулу глицина и одну - фенилаланина в качестве концевых групп. Поскольку цистин был одним из гидролитических осколков, Зангер заключил, что молекула состоит из двух пептидных цепей, связанных друг с другом посредством дисульфид-ной связи. [28]
Пометка ДНФ-груштами и последующий полный гидролиз доказали, что фрагмент с молекулярным весом 6000 включает одну молекулу глицина и одну - фенилаланина в качестве концевых групп. Поскольку цистин был одним из гидролитических осколков, Зангер заключил, что молекула состоит из двух пептидных цепей, связанных друг с другом посредством дисульфид-ной связи. [29]
Для хроматографического разделения на бумаге полиамидных гидролизатов на аминокомпоненты ( e - аминокапроновая кислота и гексаметилендиамин) в качестве растворителя оказывается пригодной смесь из 75 частей вторичного бутанола, 15 частей муравьиной кислоты ( 88 % - ной) и 10 частей воды. Аминокомпоненты определяются по флюоресценции или путем обработки реактивом Зангера, реактивом Паули или раствором нингидрина. Амино-капроновая кислота перемещается в 4 раза дальше, чем гексаметилендиамин. [30]