Cтраница 3
Четвертой, не упомянутой выше, но приобретающей в последнее время все больший интерес, задачей, разрешаемой при помощи химического изменения белков, является применение его в качестве вспомогательного средства при исследовании порядка чередования аминокислотных остатков. Работа в этом направлении была существенно облегчена введением метода Зангера [9] и весьма широко проводится английскими биохимиками. Новый способ отличается от обычного способа приготовления белковых производных или измененных белков тем, что полученные соединения гидролизуют и образующиеся производные аминокислот изолируют. Часто этим способом исследуют структуру не только нативных белков, но и продуктов неполного ферментативного или кислотного гидролиза, а также структуру продуктов частичного окисления. При разрыве поперечных цистиновых связей ( - S-S -) путем окисления до остатка цистеиновой кислоты ( - SO3H), которое также было введено Зангером [10], молекула белка распадается на отдельные полипептидные цепи. [31]
Отдельные пептиды были элюированы из хроматограммы, и методом Зангера ( динитрофенил-произнодные) были определены N-концевые аминокислоты. [32]
Прямое определение числа открытых цепей, входящих в состав молекулы белка, впервые было произведено Зангером [25] в 1945 г. С тех пор этот метод нашел широкое применение в исследованиях частичного гидролиза белка. Эти производные сравнительно устойчивы по отношению к гидролизу, и были найдены такие условия, при которых осуществляется гидролиз пептидных связей, но не затрагиваются эти динитрофенильные производные. [33]
После удаления избытка кислоты в вакууме и повторного удаления избытка с водой продукты частичного гидролиза были разделены электрофоретиче-ски в приборе с четырьмя ячейками ( Зангер и Туппи [4]) на три фракции, содержащие нейтральные, кислые и основные компоненты. В основной фракции были найдены лишь свободные гистидин и лизин. [34]
До сравнительно недавнего времени ничего не было известно о порядке расположения аминокислот в пептидных цепях белка. Только за последние несколько лет путем фракционирования продуктов частичного гидролиза белков были получены ценные данные в этом отношении. Зангер [53] изучил пептиды, выделенные при расщеплении инсулина ( см. гл. Концевые аминогруппы этих пептидов были помечены путем конденсации их с динитро-фторбензолом ( см. гл. Оказалось, что при дальнейшем гидролизе выделенные пептиды давали ДНФ-глицилизолейцин ( ДНФ символизирует динитрофевил), ДНФ-глицилизолейцилва-лин и ДНФ-глицилизолейцилвалилглицин. На этом основании был сделан вывод, что в этих пептидах аминокислоты расположены в следующем порядке: глицин-изолейцин-валин-глицин. Подобным же образом было найдено, что при частичном гидролизе бактериального токсина грамицидина С образуются следующие дипептиды и трипептиды: валилорнитин, орнитиллейцин, лейцилфенилаланин, фенилаланилпролин, про-лилвалилорнитин, валилорнитиллейцин и фенилаланилпролилва-лин. На этом основании было сделано заключение, что в грамицидине С имеется следующая цепь из аминокислот, которая, замыкаясь, образует циклопептид: / - валин - / - орнитин - / - лейцин-с. [35]
Цистин был связан с разными аминокислотами в столь различных комбинациях и положениях, что можно было подумать, будто цепи могут соединяться друг с другом поперечными связями в любом месте. Зангер скоро нашел объяснение: при кислотном гидролизе молекулы инсулина серные связи цистина освобождаются и происходят самые разнообразные перекомбинации пептидов. [36]
Поскольку обработка при таком ( восстановлении ведется в мягких условиях и приводит к хорошим выходам, этот метод представляет интерес для химика, занимающегося белками. Однако этим методом е удается открыть С-концевой аспараган в А-цепях; более того, при помощи его в молекуле инсулина обнаруживается присутствие одного [ 23а ] или двух [ 131 а ] С-концевых глициновых остатков. Если метод Зангера действительно является полным и точным, то приходится считать, что процесс восстановления вызывает разрыв некоторых особенно лабильных глициновых связей. [37]
Преимущество фтора в качестве замещаемой группы по сравнению с более тяжелыми галогенами привело к тому, что именно 2 4-динитрофторбен-зол ( реагент Зангера) находит применение как специфическое средство для характеристики первичных и вторичных аминов. Особенно широкое применение находит этот реагент для пометки концевых единиц в молекуле белков и полипептидов ( гл. Пептид обрабатывают реагентом Зангера и в образующемся веществе под действием гидролиза расщепляются амидные связи, соединяющие аминокислотные единицы в данном пептиде. Выделение и идентификация этого аминокислотного фрагмента, несущего динитрофениль-щю группу, выявляет концевую единицу данного пептида. [38]
Преимущество фтора в качестве замещаемой группы по сравнению с более тяжелыми галогенами привело к тому, что именно 2 4-динитрофторбен-зол ( реагент Зангера) находит применение как специфическое средство для характеристики первичных и вторичных аминов. Особенно широкое применение находит этот реагент для пометки концевых единиц в молекуле белков и полипептидов ( гл. Пептид обрабатывают реагентом Зангера и в образующемся веществе под действием гидролиза расщепляются амидные связи, соединяющие аминокислотные единицы в данном пептиде. Выделение и идентификация этого аминокислотного фрагмента, несущего динитрофениль-ную группу, выявляет концевую единицу данного пептида. [39]
Пептиды, впрочем, образуются при частичном разложении протеинов. Разделение такой смеси и установление последовательности аминокислот в индивидуальных компонентах смеси является предпосылкой выяснения химической структуры белков. Методы расщепления, приводящие к высшим и низшим пептидам, рассмотрены Зангером [130] ( частичный гидролиз), Крегом с сотрудниками ( [124], стр. [40]
Для того чтобы узнать, каким образом активность инсулина как гормона зависит от его строения, предстоит еще долго и много работать. Синтезировать молекулу трудно, но после того, как это будет сделано, можно будет изучать влияние изменения структуры на физиологические свойства. Очевидно, небольшие изменения не отражаются на них заметно, так как Зангер показал, что инсулин свиньи, барана и быка, обладая равной активностью, слегка отличается по своему строению. [41]
Определение аминоспиртов методом бумажной хроматографии с помощью нингидрина как проявителя в смеси со значительно большими количествами различных аминокислот представляет значительные трудности. Однако можно провести разделение обоих компонентов, если продукты гидролиза обработать динитрофторбензолом согласно методу Зангера. При этом образуются Л / - динитрофенильные производные аминокислот и аминоспиртов. [42]
И только в 1922 году, через тридцать шесть лет после открытия Минковского и фон Мерпнга, Бантинг и Бест впервые получили из поджелудочной железы белковое вещество, с помощью которого удалось понизить содержание сахара в крови. Как мы уже знаем, в 1954 году, то есть еще через 32 года, Зангер сумел полностью расшифровать строение инсулина. Интересно, сколько же потребуется времени, чтобы синтезировать инсулин и тем самым считать его изучение законченным. [43]
Высказанные выше предположения следует считать предварительными, так как для полного объяснения превращения яичного альбумина в плакальбумин требуется большее количество сведений о химическом строении этих белков. Недавно Линдерштрем-Ланг [ 151е ] предложил несколько моделей структуры яичного альбумина, которые объясняют выделение указанных двух пептидов. В одной из моделей яичный альбумин и плакальбумин имеют свободную карбоксильную группу, но не имеют ни одной концевой аминогруппы, доступной для реактива Зангера. Согласно другой модели, плакальбумин в отличие от яичного альбумина содержит свободную концевую аминогруппу. [44]
В настоящее время существует ряд методов определения концевых остатков открытых пептидов, и обозначение этих остатков поэтому должно быть четким. Было внесено два интересных предложения. Фромажо и его сотрудники [ 131 а ] исходя из того, что записываемая формула начинается с наименования остатка, обладающего свободной группой NH2, называют этот остаток начальным, а карбоксильный конец цепи - концевым остатком. Однако Бейли ( цитируемый Зангером) [329] называет их соответственно N-концевым и С-концевым остатками. Предложение Фромажо, конечно, проще, однако способ Бейли более нагляден и ие требует знания правила записи формул. [45]