Денатурирующий агент

Cтраница 2

Иммобилизованные ферменты часто проявляют повышенную устойчивость к денатурирующим агентам. [16]

Названная продукция фирмы Pharmacia устойчива к действию таких денатурирующих агентов, как мочевина и гуанидинхлорид, к изменению рН в диапазоне 3 - 14 и к нагреванию до 120 при рН 7, что позволяет ее автоклавировать. При использовании детергентов следует иметь в виду, что они из-за своей гидрофобности сами сорбируются на модифицированной сефарозе, и перед повторным употреблением колонок их следует отмывать. Рекомендована следующая последовательность операций промывки колонок, заполненных октил - или фенилсефарозой CL - 4B: промыть последовательно водой ( один объем колонки), таким же объемом этанола, двумя объемами бутанола, затем в обратном порядке этанолом и водой. [17]

Согласно этой теории, денатурация возникает вследствие разрыва денатурирующим агентом слабых связей, удерживающих пептидные цепи вместе, - разрыва, который сопровождается соответствующим изменением в расположении этих цепей. Если сочетать эту концепцию By с изложенными выше данными относительно строения глобулярных белков, то можно сказать, что при денатурации белка происходит изменение его специфической внутренней структуры, причем сложенные в складки пептидные цепи развертываются. [18]

Ионные пары могут также играть определенную роль во взаимодействии денатурирующих агентов с белками. Кристаллографическое исследование взаимодействия додецилсульфата натрия с лизоцимом показало [233], что молекулы этого детергента связываются в трех различных положениях, в каждом из которых возникает особый тип взаимодействия. Все они обладают одной общей особенностью, по-видимому, характерной для связывания додецилсульфата натрия: углеводородная цепь детергента образует гидрофобные контакты, а сульфатные группы - ионные пары с протонированны-ми аминогруппами. [19]

Молекула белка, стабилизированная дисульфидными связями, устойчива к действию денатурирующих агентов и протеолитиче-ских ферментов. Поэтому при наличии в исследуемом белке ди-сульфидных связей необходимыми этапами работы являются их восстановление и последующая модификация или окисление с образованием стабильных производных цистеина. Число дисульфидных связей в белке определяется по разности суммарного содержания остатков цистеина и количества свободных сульфгидрильных групп. [20]

Интересные наблюдения получены Хамагучи [263, 264] при добавлении к лизоциму таких денатурирующих агентов, как гуанидин, мочевина и хлористый литий. [21]

Вместе с тем число определяемых групп зав-исит и от природы денатурирующего агента. Так, при тепловой денатурации яичного альбумина в коагулированном белке удается определить только половину SH-групп, тогда как мочевина и солянокислый гуанидин освобождают соответственно 80 и 100 % тиоловых групп. Следовательно, для оценки количества скрытых SH-rpynn необходимо правильно подобрать метод определения и тип денатурирующего агента. Тем не менее в результате этих многочисленных исследований удалось не только доказать, что в денатурированном белке обнаруживается больше сульфгид-рильных групп по сравнению с нативным, но и оценить количество замаскированных групп для ряда белков. Аналогичные данные были получены и для дисульфидных групп белков. [22]

Энергия этого взаимодействия понижается при замещении атомов водорода в молекулах денатурирующих агентов алкильными группами. Упомянутые два разных механизма действия обеспечивают высокую эффективность этих соединений как денатурирующих агентов на различные типы макромолекул. [23]

Следовательно, они должны быть чувствительны к некоторым или ко всем денатурирующим агентам. Действительно, при высокой температуре фермент легко денатурируется и теряет свои характерные биохимические свойства. [24]

Помимо денатурационных воздействий тепла или рН инактивация ферментов может быть вызвана применением денатурирующих агентов, разрушающих вторичную структуру белка, таких как мочевина или гуанидинхлорид. Иногда, особенно при инактивации ферментов, включающих в активные центры тиольные группы, существенную роль играют окислительные процессы с участием кислорода. [25]

Особая лабильность ацетильной связи ацетилхимотрипснна восстанавливается в ходе диализа, приводящего к удалению денатурирующего агента и восстановлению белковой структуры. При переходе от воды к раствору мочевины меняется механизм реакции деацилирования. Так, если деацили-рование гранс-циннамоил-ос-химотрипсина в воде протекает как ферментативная реакция, то в растворе 7 74 М мочевины реакция идет по типу неферментативного катализируемого основаниями гидролиза. [26]

Модели строения некоторых олигомерных ферментов. [27]

Считают, что процесс олигомеризации придает субъединицам белков повышенную стабильность и устойчивость по отношению к действию денатурирующих агентов, включая нагревание, влияние протеиназ и др. Однако на нынешнем этапе знаний нельзя ответить однозначно на вопрос о существенности четвертичной структуры для каталитической активности ферментов, поскольку пока отсутствуют методы, позволяющие в мягких условиях разрушить только лишь четвертичную структуру. Применяемые обычно методы жесткой обработки ( экстремальные значения рН, высокие концентрации гуанидинхлорида или мочевины) приводят к разрушению не только четвертичной структуры, но и вторичной и третичной структур стабильного олигомерного фермента, протомеры которого оказываются денатурированными и, как следствие этого, лишенными биологической активности. [28]

Процесс денатурации необратим в том смысле, что белок не восстанавливает своих исходных свойств при простом удалении денатурирующего агента. [29]

В ряде работ было показано, что кинетические эффекты мицелл в присутствии и в отсутствие мочевины и других денатурирующих агентов более чувствительны к характеру и величине гидрофобных взаимодействий, чем величина ККМ. В работе [302] удалось таким путем установить некоторые особенности катализируемого основаниями гидролиза мицеллярного / г-нитрофенилдоде-каноата; константа скорости его гидролиза резко уменьшается при увеличении начальной концентрации эфира ( от 10 - 6 до 10 - 5 М), а константа скорости реакции второго порядка основного гидролиза этого эфира в мицеллярной форме ( 1 0 - 10 - 5 М) в 800 раз меньше, чем константа скорости гидролиза я-нитрофенилацетата. Уменьшение скорости, естественно, объясняется исходя из гидрофобного связывания молекул n - нитрофенилдодеканоата друг с другом, которое защищает функциональную группу эфира от атаки ионом гидроксила. В работе [236] также - было отмечено, что введение в раствор 5 0 М мочевины снижает константу скорости реакции производного гистидина 17 с длинной цепью с катионным эфиром 18 с длинной углеводородной цепью примерно в 10 раз ( разд. [30]

Страницы: 1 2 3 4