Плазмидный вектор

Cтраница 2

Рекомбинантные белки, синтезируемые в системах экспрессии S. cerevisiae. HIV-1 - вирус иммунодефицита человека 1 типа. [16]

Существует три типа экспрессирующих векторов для S. Плазмидные векторы уже широко использовались для получения как секретируемых, так и несекретируемых ге-терологичных белков. [17]

Обычно обозначение плазмидного вектора включает строчную букву р ( от англ, plasmid) и еще несколько букв, имеющих отношение к описанию вектора или к истории его создания. Родри-геса, сконструировавших эту плазмиду, а число 322 - цифровое обозначение, взятое из их исследовательских протоколов. Плазмида реплицируется с образованием большого числа копий, в другие бактериальные клетки переносится с трудом. [18]

Один из вариантов этого подхода состоит в следующем. Ген-мишень встраивают в плазмидный вектор ( рис. 8.4) и помещают препарат в две пробирки. В каждую из них добавляют по два специфических праймера для ПЦР: 1 и 2 в одну пробирку, 3 и 4 - в другую. Праймеры 2 и 3 полностью комплементарны одному из участков клонированного гена или прилегающей к нему последовательности, а 1 и 3 комплементарны другому участку, но содержат один некомплементарный нуклеотид и гибридизуются с разными цепями, так что в результате происходит замена обоих нуклеотидов данной пары. Положение сайтов гибридизации праймеров 1 и 2 в одной пробирке и 3 и 4 - в другой таково, что ПЦР-продукты в разных пробирках имеют разные концы. По окончании ПЦР содержимое пробирок объединяют и проводят денатурацию, а затем ренатура-цию. [19]

Создают банк клонов ДНК организма-донора, продуцирующего известную эндонуклеа-зу рестрикции. Используемый при этом плазмидный вектор должен содержать по крайней мере один сайт узнавания для этой рестриктазы. [20]

Схематическое изображение радиоавтографа, получающегося при секвенировании ДНК с помощью дидезокси-метода. В каждую из лунок вносили содержимое одной из четырех пробирок, в которых находился один из дидезоксинуклеотидов. ddATP, ddCTP, ddGTP или ddTTP. Нуклеотидная последовательность считывается с радиоавтографа снизу вверх. На рисунке она приведена справа. [21]

Одна из них состоит в следующем. Встраивают этот фрагмент в соответствующий плазмидный вектор и строят его подробную ре-стрикционную карту. ДНК М13, секвенируют и воссоздают нуклеотидную последовательность всего исходного фрагмента. Чтобы быть уверенным в правильности полученного результата и идентификации какого-либо нуклеотида, необходимо секвенировать обе цепи по нескольку раз. [22]

Существующая в природных условиях двухцепочечная кольцевая плазмида длиной 6318 п.н., обнаруженная в ядре Saccharomyces cerevisiae. На ее основе получены многие плазмидные векторы для дрожжевых клеток. [23]

Кроме того, создано множество плазмидных векторов, которые содержат один сайт начала репликации ДНК для широкого спектра хозяев. [24]

Если искомый ген кодирует продукт, без которого мутантная клетка-хозяин не может расти на минимальной среде, то библиотеку можно создать методом трансформации мутантных клеток. Клетки, выросшие в отсутствие необходимого субстрата на минимальной среде, обязательно содержат функциональный искомый ген, попавший в клетку в составе плазмидного вектора. В разных вариантах этот подход использовали для выделения многих важных генов, в частности генов, ответственных за синтез антибиотиков и образование азотфиксируюших клубеньков на корнях некоторых растений. [25]

Белки эукариот и вирусов, получаемые методом клонирования генов в микроорганизмах. [26]

Образование больших количеств ненужного бактериальной клетке белка ставит ее в неблагоприятное положение при отборе, так что приходится решать сложные проблемны стабилизации таких штаммов. Их удается решить - по крайней мере в случае выработки очень ценных продуктов - путем создания жестких условий отбора, направленных на сохранение плазмидного вектора, а иногда и клонируемого в нем гена. Использование индуцибельных промоторов типа ХРь препятствует постоянному синтезу продукта, и он образуется лишь в результата индукции в определенное время клеточного цикла. [27]

Зонды получают разными способами. Один из них состоит в следующем. ДНК патогенного микроорганизма расщепляют с помощью рест-рицирующей эндонуклеазы и клонируют в плазмидном векторе. Затем проводят скрининг рекомбинантных плазмид с использованием геномной ДНК как патогенного, так и непатогенного штаммов. Те плазмиды, которые содержат последовательности, гибридизующиеся только с ДНК патогенного штамма, составляют основу видоспецифичных зондов. После этого проводят ряд дополнительных гибридизаций с ДНК, выделенными из различных организмов, чтобы удостовериться, что потенциальные зонды не дают с ними перекрестной гибридизации. Для определения чувствительности метода каждый из зондов проверяют также на модельных образцах, в том числе и на смешанных культурах. [28]

Смешивают клетки трех разных штаммов. Когда клетки оказываются в непосредственной близости друг от друга, конъюгативная плазми-да, которая в данном случае обладает также мобилизационными свойствами, сама переходит в клетку, содержащую мобилизуемый плазмид - ный вектор, а затем обеспечивает перенос векторной ДНК в реципиентную клетку. В такой системе реализуются все возможные пути переноса, но подобные штаммы и плазмиды обладают такими генетическими свойствами, чтобы можно было отобрать реципиентную клетку, получившую данный плазмидный вектор. Предположим, что мы имеем три штамма: 1) штамм А, который несет конъюгативную мобилизуемую плазмиду, но не может расти на минимальной питательной среде и чувствителен к антибиотику X; 2) штамм В, который также не может расти на минимальной питательной среде и несет неконъюгативный плазмидный вектор, который имеет ген резистентности к антибиотику X; 3) штамм С - рецепиентная клетка-мишень, которая может расти на минимальной среде, не имеет несовместимых плазмид и чувствительна к антибиотику X. После конъюгации клетки непродолжительное время выращивают на полноценной среде без антибиотика X, а затем переносят их на минимальную среду с антибиотиком. В этих условиях могут расти только реципиентные клетки-мишени, которые приобрели плазмидный вектор. Иногда клетка-мишень получает обе плазмиды, однако этот редкий случай можно выявить, если перенести клетки путем перепечатки на минимальную среду и отобрать трансконъюганты, которые способны расти в присуствии антибиотика X, но не могут расти при наличии гена резистентности к другому антибиотику ( например, к антибиотику Y), который имеется в конъюгативной плазмиде штамма А. Поскольку для переноса плазмидной ДНК должна произойти-конъюгация между тремя бактериальными штаммами, эта процедура получила название тройного скрещивания. [29]

Страницы: 1 2 3