Плазмидный вектор

Cтраница 3

Рекомбинантная ДНК проникает в клетки бактерий, характеризующихся низкой частотой трансформации, таким же образом, как плаз-мидная ДНК из донорской клетки в реципиент-ную в естественных условиях. Некоторые плаз-миды обладают способностью создавать межклеточные контакты, через которые они и переходят из одной клетки в другую. Образование контактов между донорной и реципиентной клетками обеспечивается конъюгативными свойствами плазмид, а сам перенос ДНК - мобилизационными. Большинство плазмид, которые используются в работах с рекомбинантны-ми ДНК, не обладают конъюгативными функциями и поэтому не могут переходить в реципиентные клетки путем конъюгации. Однако проникновение в клетку некоторых плазмидных векторов все-таки происходит при наличии в этой клетке второй плазмиды, обладающей конъюгативными свойствами. [31]

Основной способ улучшения производства по-прежнему состоит в селекции устойчивых штаммов дрожжей. Неустойчивость частично обусловлена осмотическими эффектами, а частично - влиянием накопленного спирта на проницаемость мембран. Один из возможных выходов заключается в расширении набора используемых организмов ( путем включения, например, Z. Вторая возможность кажется особенно привлекательной, так как при работе с этими дрожжами промышленностью накоплен большой опыт. Кроме того, хорошо изучен их жизненный цикл и генетика, получены плазмидные векторы. Следует сказать, что многие используемые промышленностью штаммы дрожжей являются полиплоидными, не принадлежат к определенному типу скрещивания, а жизнеспособность образуемых ими спор низка. Все это затрудняет их генетический анализ и улучшение при помощи обычных методов скрещивания, что и заставляет обратиться к рекомбинантньш методам. Сейчас ведутся эксперименты по переносу генов амилазы и целлюлазы в клетки дрожжей. [32]

Влияние числа копий плазмиды на скорость роста хозяйских клеток1. [33]

К счастью, правильно спланировав эксперимент, можно минимизировать влияние метаболической перегрузки, оптимизировать выход ре-комбинантного белка и повысить стабильность трансформированных хозяйских клеток. В этом случае не нужно заботиться об обеспечении стабильности плазмиды. Кроме того, клетке не приходится расходовать свои ресурсы на синтез ненужных продуктов, кодируемых маркерными генами устойчивости к антибиотикам. Синтез продуктов таких генов, входящих в состав плазмидных векторов наряду с генами-мишенями, является одной из основных причин метаболической перегрузки. Интеграция в хромосому особенно важна в тех случаях, когда используется сам рекомбинантный микроорганизм, а не синтезируемый им продукт. Уменьшению метаболической перегрузки помогает также применение сильных, но регулируемых промоторов. В таких случаях ферментацию проводят в две стадии. На первой из них, во время роста, промотор, контролирующий транскрипцию гена-мишени, выключен, а на второй, во время индукции, - включен. [34]

Смешивают клетки трех разных штаммов. Когда клетки оказываются в непосредственной близости друг от друга, конъюгативная плазми-да, которая в данном случае обладает также мобилизационными свойствами, сама переходит в клетку, содержащую мобилизуемый плазмид - ный вектор, а затем обеспечивает перенос векторной ДНК в реципиентную клетку. В такой системе реализуются все возможные пути переноса, но подобные штаммы и плазмиды обладают такими генетическими свойствами, чтобы можно было отобрать реципиентную клетку, получившую данный плазмидный вектор. Предположим, что мы имеем три штамма: 1) штамм А, который несет конъюгативную мобилизуемую плазмиду, но не может расти на минимальной питательной среде и чувствителен к антибиотику X; 2) штамм В, который также не может расти на минимальной питательной среде и несет неконъюгативный плазмидный вектор, который имеет ген резистентности к антибиотику X; 3) штамм С - рецепиентная клетка-мишень, которая может расти на минимальной среде, не имеет несовместимых плазмид и чувствительна к антибиотику X. После конъюгации клетки непродолжительное время выращивают на полноценной среде без антибиотика X, а затем переносят их на минимальную среду с антибиотиком. В этих условиях могут расти только реципиентные клетки-мишени, которые приобрели плазмидный вектор. Иногда клетка-мишень получает обе плазмиды, однако этот редкий случай можно выявить, если перенести клетки путем перепечатки на минимальную среду и отобрать трансконъюганты, которые способны расти в присуствии антибиотика X, но не могут расти при наличии гена резистентности к другому антибиотику ( например, к антибиотику Y), который имеется в конъюгативной плазмиде штамма А. Поскольку для переноса плазмидной ДНК должна произойти-конъюгация между тремя бактериальными штаммами, эта процедура получила название тройного скрещивания. [35]

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, отрасль биологии, изучающая осн. Сформировалась как самостоят, наука в сер. Непосредственно связана с биофизикой, биохимией, генетикой и микробиологией. Конаревым и его учениками ( Р.Р.Ахметовым, Ш.Я.Ги-лязетдиновым и др.) проведены иссл. Здесь разработаны основы динамической теории мол. Методами генной инженерии с использованием бактериальных и фаговых генов сконструированы плазмидные векторы с управляемой экспрессией генов ( М.А.Камалетдинова), получены рекомби-нантные штаммы с заданными св-вами деградации ксенобиотиков ( Т.В.Маркушева), проводятся иссл. Методы М.б. используются при произ-ве мед. [36]

Страницы: 1 2 3