Cтраница 2
При репродукции вирусов в куриных эмбрионах появляются характерные изменения на ХАО. [16]
Для получения бляшек разные разведения вирусной суспензии наносят на однослойные культуры ткани в плоских флаконах или чашках Петри и покрывают их слоем агарового покрытия. При этом репродукция вируса и ЦПД ограничиваются только первоначально инфицированными и соседними с ними клетками. Очаги клеточной дегенерации ( бляшки) выявляют путем окрашивания культуры нейтральным красным, который либо включают в состав агарового покрытия, либо добавляют непосредственно перед учетом результатов. Бляшки состоят из погибших клеток, не окрашиваются нейтральным красным и поэтому выглядят в виде светлых пятен на фоне розово-красного монослоя. [17]
Интеграция-необходимый этап репродукции вируса; только интегрированная вирусная ДНК будет транскрибироваться. Так как интеграция в клеточную ДНК входит в жизненный цикл вируса, частота интеграции очень велика. Вероятно, вирусная ДНК может включаться в клеточную в любом месте. [18]
Через 24 - 72 ч удаляют из лунок скорлупу, а к оставшейся среде добавляют 0 5 % - ю взвесь куриных эритроцитов. Положительная РГА указывает на репродукцию вируса. [19]
Поскольку значение OD 490 прямо пропорционально экспрессии вирусных антигенов на клеточной поверхности, полученные данные позволяют сделать вывод о том, что гипорамин ингибирует репродукцию респираторно-синцитиального вируса только при добавлении его к клеткам до инфицирования. Это позволяет предположить, что его эффект на вирусную репродукцию респираторно-синцитиального вируса, так же как и в случае с вирусом гриппа, связан с ранними ее стадиями. [20]
В соответствии с целью нами были поставлены задачи изучить влияние гипорамина и его компонентов на репродукцию вируса гриппа А в клетках MDCK и его нейраминидазную активность для выявления взаимосвязи их противовирусной активности с воздействием на нейраминидазу. [21]
Выбор клеток не столь велик, но некоторые из них вполне адаптированы к условиям выращивания in vitro. В 1964 г. впервые были получены линии соединительнотканных клеток - фиброб-ластов ВНК 21 от сирийского хомяка. Эти клетки пассируются неограниченно долго и первоначально использовались для репродукции вируса ящура для приготовления соответствующих вакцин. В то же время такие клетки, как HeLa, выделенные из раковой опухоли шейки матки человека, оказались бессмертными при пассировании. [22]
Из эмбриональных тканей наиболее широко используемыми являются эмбриональные ткани цыпленка, мыши и человека. Особенной выгодой отличаются куриные эмбрионы ( по доступности) десяти-двенадцатисуточного возраста, используемые преимущественно для репродукции вирусов и последующего изготовления вирусных вакцин. Такие эмбрионы рекомендуют также для выявления, идентификации и определения инфицирующей дозы вирусов, для получения антигенных препаратов, применяемых в серологических реакциях. [23]
Необходимость регуляции транскрипции в вирусных системах связана с тем, что потребность в разных вирус-специфических белках разная: структурные белки требуются, как правило, в больших количествах, чем белки-ферменты. Кроме того, на ранних стадиях инфекции нужны преимущественно белки, обеспечивающие репликацию генома, а на поздних - белки, принимающие участие в формировании вирионов. Поэтому биологически целесообразно, чтобы разные вирусные гены считывались с разной эффективностью и чтобы эта эффективность изменялась по ходу репродукции вируса. [24]
Установлено, что гипорамин в концентрациях 10, 100 и 500 мкг / мл не оказывает токсического действия и полностью ней-трализщует репродукцию вируса в куриных эмбрионах. Клетки Уего культивировали в 24-луночных панелях в течение 48 - 72 часов и инфицировали ПМВ птиц 1 и 2 серотипов в дозе 510 - 6 10 ИДзо. [25]
В следующей серии экспериментов с использованием метода ИФА изучали влияние основных компонентов гипорамина в концентрации 1 мкг / мл и 5 мкг / мл на экспрессию вирусных антигенов в клетках MDCK, инфицированных вирусом гриппа А / Япония / 305 / 57 Установлено ( табл. 1), что активные компоненты гипорамина ( казуаринин и казуариктин в смеси) в концентрациях 1 мкг / мл и 5 мкг / мл оказывали на вирусную репродукцию сходный с гипорамином эффект. Добавление смеси, состоящей из казуаринина, стриктинина и изостриктинина, в концентрации 1 мкг / мл оказывало незначительное ингибирующее действие на значение OD 490, однако при увеличении концентрации этой смеси до 5 мкг / мл ингибирующий эффект на значение OD 490 возрастал до 90 % и был сходен с действием гипорамина в этой же концентрации. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что гипорамин и его наиболее активные компоненты ( казуаринин и казуариктин), оказывают одинаковое ингибирующее действие на репродукцию вируса гриппа А / Япония / 305 / 57 в клетках MDCK, Добавление менее активных компонентов ( смесь казуаринина со стриктинином и изостриктинином) на вирусную репродукцию снижало эффект, а неактивный компонент ( квебрахит) вообще не подавлял экспрессию вирусных антигенов в инфицированных клетках мышей. [26]
С использованием метода иммуноферментного анализа показано, что гипорамин ингибирует репродукцию респираторно-синцитиального вируса в культуре клеток, причем его ингибирующий эффект на вирусную репродукцию усиливается с увеличением его концентрации ( 21 8 % - 1 мкг / мл; 73 % - 20 мкг / мл) и уменьшается с увеличением множественности заражения клеток вирусом ( 65 5 % - 0 1 TCD / кл. Сравнительное изучение в системе ИФА гипорамина и виразола показало, что гипорамин ингибировал вирусную репродукцию практически на уровне виразола. Минимальные ингибирующие концентрации 50 ( МИК 50) этих препаратов мало отличаются и равны 5 мкг / мл для виразола и 7 мкг / мл для гипорамина. Установлено также, что ингибирующий эффект на репродукцию респираторно-синцитиального вируса связан с его воздействием на ее ранние этапы. Полученные данные перекликаются с результатами экспериментов по изучению механизма действия гипорамина в отношении вируса гриппа, показавшие, что препарат не действует на вирусную транскрипцию и трансляцию, не обладает эффектом на активность нейраминидазы-поверхностного гликопротеина вируса гриппа, участвующего в расщеплении гликозидной части нейраминовой кислоты с полисахаридной частью клеточного рецептора. С использованием метода ИФА показано, что гипорамин оказывал ингибирующий эффект на репродукцию вируса гриппа А / Япония / 305 / 57 только при добавлении его к клеткам до их инфицирования. Совокупность этих данных позволяют связать ингибирующий эффект гипорамина на репродукцию вируса гриппа и респираторно-синцитиального вируса с его воздействием на ее ранние стадии. [27]
В изучении механизма вирусспецифического действия лекарственного средства существенным является определение мишени его воздействия в звене вирусной репродукции. Поэтому особый интерес при изучении нового противовирусного средства представляют данные о воздействии его на синтез вирусспеци-фических белков. Однако, его действие может быть связано и с другими стадиями вирусной репродукции. Другим вирусным белком, играющим важную роль на различных этапах репродукции вирусов является поверхностный вирусный гликопротеин нейраминидаза. Это фермент, входящий в состав вирионов гриппа, гидролизует гликозидную связь, соединяющую кетогруппу N-ацетилнейраминовой кислоты с D-галактозой, D-галактозамином или другими сахарами. [28]
Очевидно одно - первоначальным местом действия полимера является клетка, на поверхности которой находятся заряженные группы одного или другого знака и полиэлектролит реагирует с биологической мембраной. В дальнейшем, в случае поликатионов возможно воздействие полимера с клеточной ДНК, ответственной за образование интерферона. Тот, факт, что блокада развития вирусов может осуществляться in vitro при непосредственном действии полимеров на вирусы, позволяет предположить, что полимеры тормозят репродукцию вируса на стадии освобождения нуклеиновой кислоты вирусов от белковой оболочки. Таким действием обладает, например, поливинилсульфат и другие полимеры. [29]
Установлено, что ин-гибирующий эффект гипорамина на вирусную репродукцию обратно пропорционален множественности заражения клеточной культуры вирусом от 0 1 TCD / кл. Такие же данные получены и с виразолом. Ремантадин не оказывал практически никакого действия на репродукцию респираторно-синцитиального вируса в клетках МК 2 при любой множественности заражения. [30]