Рестриктаза
Cтраница 2
 |
Некоторые рестриктазы второго типа. [16] |
Если оба отмеченных звездочкой аденина этой последовательности метилированы, то рестриктаза ничего с последовательностью не делает. Если метилирован только один аденин ( например, после репликации или репарации), то метилаза метилирует второй, используя S-аденозилметионин в качестве донора ме-тильной группы. [17]
Позже Мерц и Дэвис установили, что этот фермент, рестриктаза RI ( получившая название EcoRl), расщепляет молекулу ДНК в специфическом сайте с образованием комплементарных ( липких) концов. Линейные молекулы, образовавшиеся при расщеплении кольцевой ДНК рестриктазой EcoRl, часто вновь замыкаются в кольцо благодаря спариванию комплементарных концов. [18]
Ее добавляют в реакционную смесь после инку-бированния ДНК с двумя рестриктазами, и она отщепляет от укороченного 3 -конца цепи по одному нуклеотиду. Через определенное время реакцию останавливают и заполняют пробел с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I, используя смесь обычных четырех дезоксири-бонуклеотидов с добавлением аналога одного из них. В результате получают плазмиды, содержащие ген-мишень, в одном или нескольких сайтах которого находится аналог соответствующего нуклеотида. Плазмиды реплицируются, и в клонированный ген включается нуклеотид, отличный от такового в исходном гене. [20]
Бактерии можно не только использовать как фабрики для синтеза белков типа рестриктаз, но и получать с их помощью новые продукты, изменяя метаболизм бактериальных клеток введением в них чужеродных генов или модификацией уже существующих. Можно создавать ре-комбинантные микроорганизмы, способные синтезировать самые разные низкомолекулярные соединения: L-аскорбиновую кислоту, краситель индиго, аминокислоты, антибиотики, мономерные единицы различных биополимеров. Общая стратегия при этом состоит во введении в организм хозяина специфических генов, клонированных в подходящем векторе, которые кодируют один или несколько ферментов, катализирующих не свойственные микроорганизму метаболические реакции или влияющих на осуществляемый им в норме биосинтез определенных соединений. По имеющимся данным, создание новых метаболических путей не является технически неосуществимым. Этот подход поможет создать необычные, более эффективные пути синтеза самых разных соединений. [21]
Один из способов создания библиотеки ДНК состоит в обработке донорной ДНК рестриктазой, узнающей тетрануклеотиды. Такой рестриктазой является Sau3Al, которая вносит один разрыв примерно на 256 пар оснований. Частичный гидролиз позволяет клонировать целые гены, однако, поскольку сайты рестрикции расположены не случайным образом, некоторые фрагменты могут оказаться слишком крупными для клонирования. [23]
Подобно тому как появление транзистора привело к рождению современной электроники, открытие рестриктаз и разработка других методов генной инженерии порождают биотехнологию. Как грибы после дождя, возникают заводы и отраслевые институты, создающие на основе совершенно новых технических принципов фармацевтические препараты, вакцины, другие биологически активные вещества. Так что же достигнуто сегодня и над чем будет работать завтра вся эта армия ученых и инженеров. [24]
 |
Добавление липких концов к фрагменту ДНК, имеющему тупые концы, перед встраиванием ДНК в вектор с целью создания рекомбинантной молекулы ДНК. [25] |
Если для выделения донорной ДНК ( например, методом дробовика) использовали рестриктазу, той же самой рестриктазой должна быть обработана плазмидная ДНК. Рестрикци-онные фрагменты донорной ДНК, среди которых есть и фрагмент с нужным геном, смешивают затем с плазмидной ДНК. При смешивании они соединяются липкими концами. [26]
Вина и соавторы расщепили меченную 3Н - тимидином ДНК вируса SV-40 обработкой рестриктазой Alu I на 34 фрагмента размером от 7 до 775 пар оснований. [27]
Предполжим, например, что какой-то участок хромосомы содержит три сайта, распознаваемых рестриктазой Hindlll ( рис. 20.11, Б), при этом у всех индивидуумов сайты А и В интакт-ны. [29]
Страницы: 1 2 3 4