Рестриктаза

Cтраница 4

Один из них схематично представлен на рис. 8.7. Ген-мишень встраивают в плазмиду поблизости от двух тесно расположенных сайтов рестрикции. Эти сайты подбирают так, чтобы после расщепления двумя рестриктазами образовывались укороченные 3 - и 5 -концы, а именно, чтобы 3 -конец сайта расщепления, расположенного рядом с клонированным геном, был укорочен, а 3 -конец с другой стороны плазмиды выступал. [46]

В ДНКовых текстах часто встречаются перевертыши. Практически всегда бывают перевертышами те участки, которые узнаются рестриктазами. [47]

Конструирование рекомбинантных молекул осуществляется с помощью целого арсенала ферментов - обязательного и незаменимого инструмента практически всех этапов этого сложнейшего процесса. Речь идет прежде всего о ферментах рестрикции ( ре-стрицирующих эндонуклеазах, рестриктазах), которые узнают и расщепляют специфические нуклеотидные последовательности в двухцепо-чечной молекуле ДНК. [48]

Рестриктазы III типа являются промежуточными между ферментами I и II типов. Подобно ферментам I типа, в состав единого фермента III типа входят и рестриктаза, и метилаза. [49]

ДНК фага А, растворяют в 20 мкл раствора № 1, добавляют рестриктазу Hind III ( 2 - 4 ед. Затем смесь прогревают при 70 С в течение 10 мин и охлаждают во льду. К образцу добавляют 5 мкл глицерина ( раствор № 2) и подвергают электрофоретическому разделению в 1 % - ном геле агарозы. [50]

Нуклеотидные последовательности, распознаваемые некоторыми ферментами рестрикции. [51]

Обработка образца ДНК определенной рестрик-тазой всегда дает один и тот же набор фрагментов - при условии, что расщепление происходит по всем сайтам узнавания. На рис. 4А А указаны размеры фрагментов, полученных в результате расщепления ДНК разными рестриктазами и их смесью. [52]

Проблемой, которую каждый раз приходится решать при использовании метода Максама - Гилберта, является получение поли-нуклеотидов, меченных только по одному из концов. Обычно для анализа используются двух цепочечные фрагменты ДНК ( например, образовавшиеся после расщепления рестриктазами), а все методы введения концевых меток приводят к образованию фрагментов, меченных по двум 5 - или двум З - концам. Поэтому приходится прибегать к дополнительным операциям, таким, как разделение комплементарных цепей ДНК после введения метки. [53]

Прн работе с рекомбинантнымн молекулами ДНК возникает необходимость замены одного типа липких концов на другой. Для этой цели используются адапторные линкеры - частично двухце-почечные нуклеотиды, содержащие липкие концы, соответствующие двум разным рестриктазам. Третий тип линкеров позволяет перейти от тупого конца ДНК к липкому, и их можно назвать дополняющими. [54]

Гены, кодирующие а-амилазу, были выделены из многих микроорганизмов, в том числе из В. Для этого экстрагировали их хромосомную ДНК, частично гидролизовали ее рестрицирующей эндонуклеазой Sau3AI и встроили в обработанную рестриктазой BamHl плазмиду pUBHO, которая содержит уникальный BamHI - саРп и несет ген устойчивости к ка-намицину. [55]

Синтетический ген проинсулина человека. [56]

Смесь фагов выделяется н высевается на чашки Петри таким образом, чтобы каждый фаг дал отдельную колонию. Для отличия диких колоний от мутантных используются разнообразные методы - биологические, если мутация меняет биологическую функцию, рестриктный анализ при нарушении участков расщепления рестриктазами илн гибридизация с олигонуклеотидами, использовавшимися для введения мутаций. Последний метод основан на том, что неполностью комплементарные олигонуклеотнды образуют с ДНК значительно менее стабильные комплексы, чем комплементарные олигонуклеотнды и гибридизующиеся при более высоких температурах. Поэтому гибридизация с ДНК фагов, фиксированных на нитроцеллюлозных фильтрах, при низких температурах приводит к образованию комплексов как с мутантными, так и с дикими ДНК, а при высоких - только с мутантными, которым синтетический олигонуклеотид полностью комплементарен. [57]

Страницы: 1 2 3 4