Рестриктаза
Cтраница 3
Такие молекулы смешивают с донорной ДНК, содержащей нужный ген и предварительно обработанной такой же рестриктазой. Поскольку липкие концы этих двух ДНК взаимно комплементарны, они спариваются с образованием гибридных молекул. Далее смесь обрабатывают ДНК-лигазой фага Т4 в присутствии АТР, в результате чего образуется множество разных комбинаций фрагментов, а также нежелательные продукты, в частности объединившиеся между собой фрагменты до-норной ДНК и исходные плазмидные ДНК. После репликации в трансформированной клетке одноцепочечные разрывы устраняются системой лигирования клетки-хозяина. [31]
РНК) указывает на необходимость соблюдения высочайшей точности процедуры вырезания необходимого гена из ДНК генома соответствующими рестриктазами. В противном случае могут быть получены не структурные транслируемые гены, а интроны или участки экзонов, не кодирующие белок. После того как были разработаны методы искусственного синтеза и сшивки отдельных участков молекулы ДНК, появилась возможность конструирования и создания новых, неизвестных ранее в природе организмов с заранее заданными свойствами. [32]
Регуляция транскрипции на уровне последовательности РНК, уже скопированной с генома, происходит за счет белков рестриктаз и лигаз, к-рые разделяют РНК на блоки; нек-рые из них отбрасываются ( интроны), а другие ( экзоны) сшиваются лигазами и поступают в аппарат биосинтеза белков. [33]
Такими комплементарными последовательностями могут быть, в частности, одноцепочечные участки, образующиеся при расщеплении ДНК какой-либо рестриктазой. [34]
Если для выделения донорной ДНК ( например, методом дробовика) использовали рестриктазу, той же самой рестриктазой должна быть обработана плазмидная ДНК. Рестрикци-онные фрагменты донорной ДНК, среди которых есть и фрагмент с нужным геном, смешивают затем с плазмидной ДНК. При смешивании они соединяются липкими концами. [35]
Для клонирования в pUC19 донорную ДНК расщепляют одной из рестриктаз, чей сайт находится в полилинкере; плазмидную ДНК гидроли-зуют такой же рестриктазой, а затем обрабатывают щелочной фосфатазой. Обе ДНК смешивают в присутствии ДНК-лигазы Т4 и используют образовавшийся продукт для трансформации клеток, которые могут синтезировать ту часть р-галактозидазы ( LacZa), которая соединяется с продуктом гена lacZ с образованием активного фермента. Обработанные клетки высевают на питательную среду с ампициллином, ИПТГ и субстратом для Р - галактозидазы. Нетрансфоми-рованные клетки не могут расти в присутствии ампициллина, а клетки, несущие интактную плазмиду, образуют на среде с ампициллином колонии синего цвета. [36]
Этот первый метод выделения генов был разработан в конце 1960 - х - начале 1970 - х гг. Его появление стало возможным благодаря открытию ферментов, называемых рестрикци-онными ( от англ, restricting - ограничивающий) эндонуклеазами или рестриктазами. Эти ферменты обнаруженные в бактериях, способны разрезать ДНК, например они разрезают любую вторгающуюся в бактериальную клетку вирусную ДНК, ограничивая ( рестрицируя) таким образом размножение вирусов внутри клетки. Разные виды бактерий продуцируют различные рестрикционные эн-донуклеазы. Фермент распознает некую последовательность оснований и взаимодействует именно с ней. Точки разрезания называются сайтами рестрикции. К настоящему времени выделено более 2000 рестриктаз, активных в отношении 230 разных последовательностей. Свою собственную ДНК бактерия защищает путем присоединения к определенным основаниям в сайтах рестрикции метиль-ной группы. [37]
Один из способов создания библиотеки ДНК состоит в обработке донорной ДНК рестриктазой, узнающей тетрануклеотиды. Такой рестриктазой является Sau3Al, которая вносит один разрыв примерно на 256 пар оснований. Частичный гидролиз позволяет клонировать целые гены, однако, поскольку сайты рестрикции расположены не случайным образом, некоторые фрагменты могут оказаться слишком крупными для клонирования. [38]
Подобная сложность систем рестрикции I типа привела к предположению о том, что эти ферменты играют в клетках какую-то роль помимо рестрикции. Однако другие функции рестриктаз пока не обнаружены. [39]
Эти ферменты известны под общим названием эндонуклеазы рестрикции. Сокращенно эндонуклеазы рестрикции называют рестриктазами. В табл. 7.5 перечислены некоторые из наиболее широко используемых при изучении структуры ДНК и других биохимических исследованиях рестриктазы. [40]
Если в хозяйской клетке экспрес-сируется ген фермента рестрикции, то она оказывается устойчивой к литическому действию фагов типа А. ДНК которых активно расщепляется синтезируемой рестриктазой. [41]
Нативная плазмида может быть использована в качестве вектора только после соответствующей модификации. Сначала ее переводят в линейную форму при помощи рестриктазы с образованием тупых концов. Линкер присоединяют к ДНК, а затем при помощи соответствующей рестриктазы получают фрагмент ДНК с липкими концами. [42]
Одноцепочечные ДНК нек-рых фагов модифицируются или подвергаются рестрикции только тогда, когда они находятся в фазе репликации. В то же время для обеспечения устойчивости к рестриктазам достаточно модификации только одной из цепей ДНК. По этой причине ДНК, образующаяся в ходе полуконсервативной репликации, защищена от действия собств. [43]
Позже Мерц и Дэвис установили, что этот фермент, рестриктаза RI ( получившая название EcoRl), расщепляет молекулу ДНК в специфическом сайте с образованием комплементарных ( липких) концов. Линейные молекулы, образовавшиеся при расщеплении кольцевой ДНК рестриктазой EcoRl, часто вновь замыкаются в кольцо благодаря спариванию комплементарных концов. [44]
Страницы: 1 2 3 4