Cтраница 4
Рибонуклеаза панкреатическая - фермент, осуществляющий гидролиз дрожжевой РНК. Обнаружен Джонсом в панкреатической железе. Панкреатическая РНК-аза расщепляет РНК с образованием З - монофосфатов или же олигонуклеотидов с 3 -фосфатным нуклеотидом на конце. При температурах выше 65 С панкреатическая рибонуклеаза инактивируется. В результате структурных исследований нолностью расшифровано первичное строение этого белка-фермента и осуществлен его полный химический синтез. Панкреатическая РНК-аза расщепляет связь между фосфатом, присоединенным к атому С-3 - пиримидинового нуклеотида, и С-5 - кислородом соседствующего с ним нуклеотида. Внутримолекулярная атака фермента на фосфодиэфирную связь происходит при участии 2 -гидроксильной группы. При этом обязательно образуется промежуточный 2 - 3 -циклофосфат, который затем гидролизуется тем же ферментом с образованием свободного пиримидин - З - фосфата или же олигонуклеотида с пиримидин - З - фосфатным нуклеотидом на конце. Нельзя считать абсолютной специфичность панкреатической РНК-азы по отношению к пиримидиновым нуклеотидам, поскольку диэфирные связи в полинуклеотиде, возникающие при наличии Аф, также расщепляются ферментом, хотя и в значительно меньшей степени, чем фосфодиэфирные, образующиеся пирими-динами. [46]
Повторное свертывание модифицированных белков дает информацию о процессе свертывания. Исследования повторного свертывания нативных белков были дополнены опытами по повторному свертыванию модифицированных белков. В ранних исследованиях 445 ] было показано, что рибонуклеаза поджелудочной железы, нодинированная по расположенному на поверхности нативной структуры Туг-115, после денатурации теряет способность к повторному свертыванию. Эго показывает, что состояние остатка Туг-115 имеет важное значение для процесса свертывания. Для того чтобы установить, можно ли модифицировать белок ( путем расщепления цепи и делеций в последовательности или путем присоединения объемных групп к боковым цепям) без потери им способности к свертыванию, был проведен ряд систематических исследований нуклеазьг стафилококка и панкреатической рибонуклеазы. [47]
Первая группа - близкие аналоги субстратов, содержащие весь набор или, по крайней мере, большую часть групп, узнаваемых активным центром фермента, и поэтому образующие комплекс фермент - аналог, сходный с комплексом фермент - субстрат. Однако в силу специфики своей структуры они не подвергаются ферментативному превращению. Занимая активный центр, эти аналоги препятствуют связыванию субстрата и тем самым ферментативной реакции. Например, соединение ( 95) имеет весь набор групп, узнаваемых панкреатической рибонуклеазой ( см. рис. 59, 60), но CJb-группа, стоящая вместо атома 5 - 0 субстрата, не способна принять протон от протонированного His-119 и расщепления связи Р - - С не происходит. Фенилпропионовая кислота содержит карбоксильную группу и гидрофобный фенильный радикал, в связи с чем связывается с активным центром карбокси пептид азы А ( см. рис. 62), но не имеет амидпой группировки и никакому превращению ферментом поэтому не подвергается. Оба указанных соединения являются типичными конкурентными ингибиторами соответственно панкреатической рибонуклеазы и карбоксипептидазы А. [48]
Возможно, что рибонуклеозид-5 - трифосфаты являются истинными промежуточными предшественниками РНК. Такие общие ЦЦА-концевые группировки найдены в низкомолекулярных растворимых РНК, которые служат переносчиками аминокислот при биосинтезе белков. Кратковременная обработка диэстеразой змеиного яда освобождает эти концевые группы и нарушает биологическую активность. Последняя может быть восстановлена при инкубации продукта с очищенной ферментной системой и рибонуклеозид-5 - трифосфатами. Фракционированием транспортного РНК-белкового комплекса была получена частично очищенная ферментная система, которая катализирует пирофосфоролиз только трех концевых нуклеотидов в присутствии неорганического пирофосфата. Аналогичным исследованием, в котором меченый полимер гидролизовали панкреатической рибонуклеазой ( вновь с переносом Р32), было показано, что около 65 % препарата содержит пиримидин - АЦЦА-концевые группы, а 17 % содержат на акцепторном конце последовательность пиримидин - ГЦЦА. При изучении гидролизата были найдены и другие концевые последовательности, например фЗТАЦЦА ( 3 1 %), фЗ АГЦЦА ( 3 6 %), фЗ ААЦЦА ( 1 1 %), фЗ УАЦЦА ( 7 2 %) и фЗ АУЦЦА ( 1 4 %), причем всем им должны предшествовать пиримидиновые нуклеотиды. [49]
Путь б - специфическое расщепление полинуклеотидной цепи на блоки с последующей расшифровкой строения образующихся таким путем блоков и воссозданием первичной структуры исходного полимера - предъявляет значительно менее жесткие требования к специфичности и полноте протекания превращений. Расщепление проводится однократно, и возникающие при этом ошибки не накапливаются. Для избирательного расщепления полинуклеотидной цепи могут быть использованы химические или химико-ферментативные методы. В первом случае необходимо, чтобы химиче-v екая модификация приводила к лабилизации межнуклеотидных А связей. Такие реакции, обладающие групповой специфичностью j ( разрушение всех пиримидиновых или отщепление всех пуриновых у оснований), широко используются для изучения распределения нуклеотидов в молекуле ДНК. Аналогичные методы для РНК об - ладают более высокой специфичностью. Второй метод расщепле-i ния - химико-ферментативный - заключается в избирательном химическом изменении структуры определенных нуклеозидных звеньев, приводящем к повышению стабильности соответствующих межнуклеозидных связей к действию нуклеаз, и последующем действии нуклеаз. Так, после модификации урацильных ядер гидр-оксиламином или карбодиимидом панкреатическая рибонуклеаза расщепляет РНК только по цитидиновым звеньям, что равносильно использованию цитидил-рибонуклеазы, не найденной в природных объектах. [50]