Cтраница 3
При этом объем анализируемой пробы уменьшается и анализируемая смесь входит в колонку в виде узкой зоны. Поскольку колонка с введенной в нее пробой установлена в хроматографе, анализ можно выполнить за одну операцию путем программирования температуры. Головная часть колонки заполняется на 3 - 5 см стеклянными шариками диаметром 0 2 мм, на которые не нанесена жидкая фаза. Таким образом создается узкая стартовая зона в начале колонки. Перенос компонентов паровой фазы в головную часть колонки осуществляется током инертного газа, а не за счет разрежения на выходе колонки. [31]
Ионообменную хроматографию белков [20] выполняют на ионообменниках, имеющих гидрофильную матрицу, например на целлюлозе и декстране. Анионообменники, особенно DEAE-целлюлозу и DEAE-сефадекс, используют чаще, чем катионооб-менники типа СМ-целлюлозы. Ионообменники на основе целлюлозы имеют открытую сетчатую структуру с ионизованными центрами, легкодоступными для белков. Число ионных связей, образующихся между обменником и белком, зависит не только рт используемого материала, но также в большой степени от рН и ионной силы буфера. Эти ионные пары постоянно диссоциируют и образуются вновь, так как ионы элюента конкурируют за центры обмена. Обменники, пригодные для фракционирования белков, имеют низкую плотность зарядов, поэтому число ионных связей между ионитом и отдельными молекулами белка не столь велико, чтобы вообще воспрепятствовать продвижению последних вдоль колонки. Хотя ионные связи постоянно диссоциируют и образуются вновь, в начале хроматографирования белок связывается с ионообменником и не элюируется с колонки. Однако когда концентрация небольших конкурирующих ионов буфера возрастает до такого уровня, что все связи одновременно разрываются, белок начинает двигаться вниз по колонке. Если в процессе разделения используют градиент ионной силы, белок, перемещающийся в стартовой зоне медленнее, чем буфер, элюируется им при увеличении концентрации ионов. Таким образом, элюирующая способность буферного раствора постоянно увеличивается и макромолекула перемещается все быстрее и быстрее. Скорость ее перемещения становится сравнимой со скоростью движения жидкости, когда в элюенте достигается такая концентрация соли, которая эффективно препятствует взаимодействию молекулы белка с обменником. Важное значение в каждом отдельном случае имеет профиль градиента: чтобы увеличить разрешение пиков в определенных участках хромато-граммы, используемый градиент должен быть сравнительно пологим, но в то же время достаточно крутым в других участках, чтобы избежать уширения пиков. [32]
Если приходится фракционировать значительный объем материала, желательно наносить его на сухую, а не на влажную бумагу. Большой объем наносимого материала, естественно, пропитывает значительную площадь бумаги. Если подсушивать место старта, можно частично ограничить растекание наносимого раствора. Правда, в этом случае создается опасность необратимой адсорбции некоторых пептидов на бумаге; особенно это относится к большим пептидам, и поэтому такого подсушивания следует избегать. Однако, если область старта действительно занимает слишком большую площадь, наносимый материал можно сконцентрировать следующим способом. Сразу после нанесения образца бумагу кладут на чистое стекло. Увлажненную область старта с помощью двух стеклянных палочек приподнимают так, чтобы она не касалась стекла. Продвигая кончик пипетки параллельно линии старта примерно на расстоянии 1 см от увлажненной области, смачивают буферным раствором бумагу вокруг нее. Буферный раствор должен свободно выходить из пипетки и впитываться в бумагу. Увлажнение повторяют несколько раз по обе стороны стартовой зоны, пока она полностью не пропитается буферным раствором. После этого смачивают всю остальную площадь листа фильтровальной бумаги. Очень важно, чтобы нанесенный материал в стартовой области имел рН используемого буферного раствора. Особенно это существенно в тех случаях, когда лиофилизированный образец наносится в растворе аммиака. Поскольку этот раствор имеет более высокое значение рН, чем обычно используемый буферный раствор, важно, чтобы последний был достаточно емким. Обеспечить нужный рН в месте нанесения образца можно довольно простым приемом. [33]