Скорость - элюция
Cтраница 4
 |
Хроматограмма РСО гинзенозида Rgi.| Хроматограмма экстракта женьшеня сухого. [46] |
Милихром, оснащенный стальной колонкой 2 80 мм с Separon SGX CIS S, 5 мкм. Подвижная фаза - смесь метиловый спирт - вода ( 50: 50), скорость элюции 100 мкл / мин. Проводят УФ-детектирование при длине волны 204 нм. [47]
 |
Совмещенные хроматограммы бензола, полученные. [48] |
Показано, что с уменьшением Ds снижается емкость пористого сорбента. В работе [103] экспериментально обнаружено увеличение асимметрии и уменьшение удерживаемого объема пика высокомолекулярного полистирола при увеличении скорости элюции; при этих же условиях V стирола не меняется. [49]
Увеличение размеров зерен сорбента при заданном давлении на входе в колонку инициирует одновременно два эффекта: рост скорости элюции и рост неравновесности процесса, что приводит к дополнительному размыванию вещества. В определенной области изменения dp влияние этого размывания на время анализа менее значительно, чем влияние роста скорости элюции. Это приводит к сокращению времени анализа. Начиная с некоторого размера зерен, увеличивающееся размывание вещества полностью компенсирует влияние роста скорости элюции на время анализа, а затем начинает и превышать это влияние. При этом наблюдается увеличение времени анализа вместе с увеличением размеров зерен сорбента. [50]
Например, в 1979 г. было описано фракционирование нативных белков с молекулярными массами 12 - 68 тыс. Дальтон на колонках Lichrosorb-DIOL ( 5 мкм) размерами 0 6 х 25 и 2 3 х 25 см. Авторы сообщили об успешном разделении классического набора стандартных белков ( БСА, овальбумин, химотрипсиногеп, лизоцим, цитохром с), о линейной зависимости log M от VR и подчеркнули, что все фракционирование у них занимало 6 мин. Если мы сравним эту цифру с той, что была приведена выше при описании построения калибровочного графика ( см. рис. 72) для сефадекса G-75 Superfine с использованием тех же белков, то увидим, что скорости элюции различаются более чем в 100 раз. Возникает вопрос - правомерно ли такое увеличение скорости, если иметь в виду, что средний диаметр гранул уменьшен только в 5 - 6 раз. Успевает ли установиться равновесие поперечной диффузии между фазами. Имеется ли выигрыш в эффективности разделения фракций, который можно ожидать от ЖХВД, или авторы пожертвовали им ради скорости процесса. Кстати говоря, такая жертва может быть целесообразной при работе с очень лабильными белками, но в большинстве случаев биохимик-исследователь, вероятно, предпочел бы увеличить длительность опыта до часа или даже нескольких часов, если бы это сулило ему существенный выигрыш в разрешении белковых фракций. Только ради экономии времени вряд ли имеет смысл в биохимической лаборатории идти на внушительные затраты средств, связанные с приобретением колонок и аппаратуры для ЖХВД. [51]
 |
Расстояние между узкими хроматографичесшши зонами, мигрирующими по колонке ( слева направо.| Расстояние между широкими хроматографичесшши зонами с площадкой. [52] |
Из формулы ( 21) следует, что улучшать разрешение эффективнее не за счет длины колонки, а за счет выбора хроматографической системы, обеспечивающей более выраженное различие сродства двух веществ к неподвижной фазе. Следует подчеркнуть, что если хро-матографическая система разделения близких зон отработана на малой колонке, то при переносе ее на колонку большего размера следует увеличивать объем только за счет ее диаметра, оставив подобранную длину колонки неизменной. Скорость элюции ( мл / ч) следует повысить пропорционально увеличению площади сечения колонки, с тем чтобы линейная скорость течения подвижной фазы ( или, что то же самое, расход элюента в расчете на 1 см2 площади сечения колонки) оставалась неизменной. [53]
Авторы исследования отдают предпочтение сорбенту j - Bon-dapak - Phenyl при ион-парной хроматографии. По их данным, ал-килфенильный сорбент хорошо разделяет как крупные пептиды ( до М 25 000), так и мелкие. При скорости элюции 0 8 мл / мин ( 400 мл / см2 - ч), комнатной температуре и среднем размере гранул 10 мкм на колонке указанного типа размером 0 39 х 30 си они получали симметричные пики пептидов в то время как на октиловой ( Ultrasphere RP-8; 5 мкм; 0 46 х 25 см) и октадециловой ( Zorbax ODS; 6 мкм; 0 46 X 25 см) колонках в аналогичных условиях элюции пики оказывались несимметричными. [54]
Следовательно, расширение зон и ухудшение разрешения пиков при хроматографии макромолекул обусловлены главным образом трудностью установления равновесия обмена между фазами. Это обстоятельство, в свою очередь, требует уменьшения скорости элюции. Продольная диффузия большой роли здесь не играет. [55]
Имея в виду исчерпывающий гидролиз белка концентрированной НС1 и нежелательность введения этапа нейтрализации гидроли-зата, следует ориентироваться на элюцию в кислом буфере, когда аминокислоты заряжены более или менее положительно; следовательно, надо использовать сильную катионообменную смолу. Наконец, в интересах сокращения продолжительности анализа за счет увеличения скорости элюции ( в случае аминокислот вполне допустимого) к обменнику следует предъявить требование повышенной жесткости. Всеми этими качествами обладают специально разработанные для аминокислотного анализа катионообменники типа Aminex фирмы Bio-Rad и их аналоги, выпускаемые фирмами Durrum и Beckman и перечисленные в гл. [56]
Выбор граничных значений концентрации соли ( или рН) градиента элюции был рассмотрен в предыдущем разделе. Объем градиента определяет его крутизну. Слишком крутой градиент может быть причиной плохого разрешения соседних хроматографических зон ( пиков) вещества, а чересчур пологий невыгоден из-за увеличения продолжительности хроматографии, поскольку скорость элюции лимитирована процессами диффузии вещества. Выбор объема градиента приходится вести эмпирически. Если пики веществ плохо разделяются, объем градиента увеличивают, если они излишне разнесены друг от друга - уменьшают. Если плохое разрешение пиков наблюдается только в начале линейного градиента, то следует перейти на вогнутую его форму, если только в конце - на выпуклую. Способы создания таких нелинейных градиентов описаны в гл. Возможна ситуация, когда при элюции линейным градиентом компоненты смеси выходят в виде нескольких групп пиков, далеко отстоящих друг от друга, но плохо разрешенных внутри каждой группы. В этом случае следует построить составной градиент, в котором пологие линейные участки, отвечающие областям элюции каждой группы, будут чередоваться с крутыми участками градиента между группами. Обычно оптимальная крутизна градиента отвечает 5 - 20-кратному отношению его объема к объему колонки. [57]
Страницы: 1 2 3 4