Спектр - белок
Cтраница 3
Сильнопольная область спектра лизоцима ( 8 5 т) была интерпретирована, главным образом, с учетом сдвигов, обусловленных влиянием кольцевых токов ( см. разд. Такие сдвиги, безусловно, имеют место я в более слабовольных частях спектра, но их трудно обнаружить вследствие перекрывания большого числа резонансных сигналов. Кольцевые токи могут вызывать сдвиги в сильное и в слабое поле. Это подтверждается тем, что в спектре денатурированного лизоцима наблюдается один широкий пик при 9It ( см. рис. 14.4 6), в то время как в спектре дативного белка ( рис. 14.6 и 14.7) этот пик расщепляется на несколько малых пиков, смещенных как в более сильные, так и в более слабые поля. [31]
Корреляцию знака эффекта Коттона с хиральностью хромофора обычно получают эмпирически в виде соответствующих правил. КД соответствует конформация, скрученная по правой спирали, а отрицательному - по левой. Это правило носит назв. Его широко применяют для определения абс. Особенно часто эффект экситонного расщепления встречается в спектрах белков и нуклеиновых к-т. Методы ДОВ и КД позволяют определять содержание вторичных структур в белках и полипептидах. [32]
Основной недостаток работ, проведенных на более раннем этапе, состоит в том, что в качестве растворителя применялась вода. Позднее было показано, что превосходным растворителем для этих соединений является трифторуксусная кислота [159], применение которой позволяет использовать в качестве внутреннего эталона тетраметилсилан. В этом растворителе, так же как и в сильнокислых водных растворах, основные группы присоединяют протоны. Поэтому пептиды, амиды и сульфгидрильные группы дают сигналы ЯМР, тогда как гидроксильные и карбоксильные группы обмениваются слишком быстро, чтобы их можно было зафиксировать. Пользуясь полученными данными, Бови и Тиерс [20] показали, что знание положения сигналов может помочь интерпретации спектров ЯМР белков. Объектами их обстоятельной работы были следующие аминокислоты: глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, оксипролин, бетаин, фенилаланин, тирозин, триптофан, серии, треонин, цистеин, цистин, метионин, лизин, орнитин, аргинин, гистидин, аспарагиновая и глутамино-вая кислоты, а также некоторые N-ацетилпроизводные аминокислот и простейшие пептиды. Следует отметить, что оптические изомеры дают идентичные спектры ЯМР, так что варьирование соотношения этих изомеров не должно оказывать заметного эффекта. [33]
Как правило, для подтверждения выполнимости второго критерия существования водородной связи в каждом конкретном случае используются спектроскопические методы. Характеристические частоты валентных колебаний О - Н и N - Н трудно наблюдать в ИК-спектрах водных растворов полипептидов и белков из-за необходимости разрешения широких полос поглощения, осложняемого фоновым поглощением растворителя, насыщенного водородными связями. Развитие спектроскопии комбинационного рассеяния света обещает дать средства для преодоления этих трудностей. Для иллюстрации влияния акцепторного атома на группу Y используются также данные о характеристических химических сдвигах резонансов Н или X в спектрах ЯМР малых молекул. Хотя применение спектроскопии ЯМР позволило достичь значительных успехов в определении существования водородных связей у пептидов в растворах, спектры ЯМР белков при доступных разрешающих способностях имеют ограниченную применимость к установлению конкретных водородных связей. [34]
Спектр протонного магнитного резонанса белка охватывает узкий интервал частот и представляет собой наложение большого числа резонансных сигналов. Два свойства гемовых белков несколько облегчают решение проблемы. Во-первых, гемовая группа индуцирует сдвиг, обусловленный кольцевыми токами ( по аналогии с бензолом 15, 251), что приводит к смещению резонансных линий ядер, находящихся вблизи тема, в область, отделенную от основной огибающей спектра. Во-вторых, гемовое железо может быть парамагнитным и тогда оно индуцирует изменения химических сдвигов и уши-рение резонансных сигналов, соответствующих ядрам в ближайшей окрестности гемовой группы. На практике это приводит к тому, что спектр ЯМР распространяется на интервал частот, примерно в 5 раз превышающий интервал частот в спектрах ЯМР обычных белков. [35]
 |
Зоны, полученные при электрофокусировании в течение 40 мин коммерческих препаратов гемоглобина ( Sigma Chemical Company овцы ( слева и быка ( справа. [36] |
Точное сравнение положения соответствующих зон в спектрах разделения различных образцов представляется затруднительным. Она имеет два отделения в верхней части, позволяющие одновременно вносить два образца. В данном случае перегородка выполнена из стекла, впаянного в трубку. Однако это может быть подклеенный или жестко заклиненный пластик. На рис. 13 и 14 приведены примеры использования такой трубки для сравнения компонентов гемоглобина с одинаковыми изоточками и соответственно сопоставления состава глиадинов различных сортов пшеницы. Кроме того, этот метод находит применение для сравнения спектра частично очищенного белка с исходным экстрактом. [37]
Например, спектры КД белков, свободных и входящих в состав мембранных фрагментов, существенно отличаются: на спектрах белков в составе мембран наблюдаются характерное сглаживание и сдвиг пиков в длинноволновую область. Аналогичные эффекты наблюдаются для спектров ДОВ. Эти эффекты объясняют тем, что пучки с правой и левой круговой поляризации рассеиваются частицами с входящими в их состав оптически активными веществами в неодинаковой степени. Подтверждением такому объяснению служит зависимость формы спектра КД от геометрии расположения детектора ( фотоумножителя) и образца. Приближение образца к детектору в значительной степени устраняет различие в спектрах белков, свободных и входящих в состав мембран. [38]
Например, спектры КД белков, свободных и входящих в состав мембранных фрагментов, существенно отличаются: на спектрах белков в составе мембран наблюдаются характерное сглаживание и сдвиг пиков в длинноволновую область. Аналогичные эффекты наблюдаются для спектров - ДОВ. Эти эффекты объясняют тем, что пучки с правой и левой круговой поляризации рассеиваются частицами с входящими в их состав оптически активными веществами в неодинаковой - степени. Подтверждением такому объяснению служит зависимость формы спектра КД от геометрии расположения детектора ( фотоумножителя) и образца. Приближение образца к детектору в значительной степени устраняет различие в спектрах белков, свободных и входящих в состав мембран. [39]
Полосы Амид I и Амид II являются характерными полосами гранг-амидных групп благодаря их устойчивому положению ( 1640 и 1545 см-1) и большой интенсивности. Точное положение полосы Амид II различно для а - и - модификации полиамидов. Подобная интерпретация полос подтверждается спектрами дейтерированных образцов. Полоса поглощения, соответствующая деформационному колебанию ND-группы, лежит при 970 см 1 и обозначается как Амид ИГ. В работах [1166, 1171] рассмотрели расщепление полос Амид I и II в спектрах белков в результате внутри - и межмолекулярнэго взаимодействия в кристалле ( см. разд. Показано [177], что полоса Амид I в спектрах а-модификаций полиамидов, полученных из со-амино-карбоновых кислот, имеет перпендикулярную ( 1640 см-1) и слабо интенсивную параллельную ( 1665 см 1) компоненты. [40]
При этом, так как в этой модели время вращательной корреляции спиновой метки относительно глобулы не определяется, а считается быстрым во временной шкале ЭПР, то мы синтезировали спектры, задаваясь Тц0 1 и 1 не, считая последнее время границей быстрого движения. Слева приведены аналогичные спектры 3-сантиметрового диапазона. Из приведенных спектров видно, что действительно пики, обусловленные Gxx - и ( г - компонентами тензора, сливаются в один соответствующий GL, и остается группа линий, связанная с ( г и At компонентами тензоров. Причем зта характерная особенность в спектрах сохраняется вплоть до границы быстрого движения. Таким образом, модель САД спиновой метки при регистрации спектров ЭПР в 2-миллиметровом диапазоне может быть легко подтверждена или опровергнута. Причем для этого не нужно проводить весь вязкостный эксперимент, а достаточно зарегистрировать спектр спин-меченого белка в воде. На рис. 9, в ( справа) приведен снектр ЭПР спин-меченого БСА в воде, зарегистрированный на 2-миллиметровом ЭПР-спектрометре в тех же условиях, что и 3-сантиметровый спектр ЭПР ( слева) этого же образца. Видно, что ни о какой аксиальности тензора G не может быть и речи, а следовательно, и модель САД спиновой метки в этом случае нельзя считать удовлетворяющей эксперименту. При этом следует отметить, что эксперимент в 2-миллиметровом диапазоне в отношении модели САД спиновой метки является прямым экспериментом по сравнению с З - сануиметровым диапазоном. [41]
Страницы: 1 2 3