Среда - инкубация
Cтраница 3
Тонкие срезы ( 200 - 250 мкм) коры больших полушарий или полосатого тела мозга, приготовленные методом Мак Ильвеина [625], инкубируют в среде инкубации при 37 С и аэрации кислородом с разными концентрациями тестируемого вещества. [31]
В оптимальных ( по рН) условиях действия фенилаланина анализируют зависимость скорости реакции от концентрации ингибитора 0 1 - 10 мМ в отсутствие и в присутствии в среде инкубации 5 мМ ала-нина. В отдельном эксперименте исследуется влияние 5 мМ аланина на активность пируваткиназы. В работе используются свежевыделенные препараты растворимой клеточной фракции, а также после 2-кратного размораживания. Анализируют характер ингибирующего воздействия фенилаланина на пируваткиназу, оценивая NH по эффектору. [32]
При экстракции ткани фосфатным буфером происходит вымы-ьание не только ферментов цикла Кребса, но и цитохрома с, так что высокие оксидазные активности препаратов могут быть получены только при добавлении цитохрома с в среду инкубации. [33]
Среда инкубации: 0 5 М КС1, 0 02 - 0 04 мМ трис - НС1, 1 - 2Х ХЮ-2 М СаС12, 5 - 7 мг / мл АТФ, рН среды инкубации доводится до 7 6 после смешивания всех компонентов. [34]
Многие из исследованных соединений ( фосфат, цитрат, пирофос-фат, ацетат, HEPES, MOPS, MES, BES, PIPES, трис, какодилат, фор-миат, дитиотреитол, ЭГТА, глицин, тирозин, а также аденозин, АТФ, тимидин, ДНК, РНК, полиадениловая кислота) не влияют на развитие окраски. Наличие в среде инкубации амфолинов вызывает значительное увеличение оптической плотности. Поскольку белки различаются по своей способности связывать красители, желательно строить калибровочный график с использованием того белка, концентрацию которого в дальнейшем предполагают определять. [35]
В каждую из них добавляют по 0 2 мл густой суспензии митохондрий ( 20 - 25 мг белка) и пробы инкубируют в течение 3 мин при комнатной температуре. Митохондрии отделяют от среды инкубации быстрым центрифугированием суспензии в 0 88 М раствора сахарозы. Предварительно охлажденную до 0 С сахарозу разливают по 7 мл в 4 центрифужные пробирки от супернасадки ЦЛР-1, стоящие на льду. После инкубации колбы быстро охлаждают и их содержимое осторожно с помощью пипетки наслаивают на поверхность раствора 0 88 М сахарозы. Осторожно помещают пробирки в охлажденный ротор супернасадки и центрифугируют при максимальной скорости вращения ( 18000 об / мин) в течение 10 мин. Верхний слой отсасывают пипеткой, а раствор сахарозы сливают. Добавляют в центрифужные стаканчики по 1 5 мл 5 % - ной трихлоруксусной кислоты, осадки тщательно размешивают стеклянной палочкой и центрифугируют при 5000 g 10 мин. Супернатанты собирают в пробирки и экстракцию повторяют еще раз. Объединенные супернатанты нейтрализуют концентрированным раствором NaOH, добавляют 1 мл 1 М раствора NaOH и объем доводят до 10 мл бидистиллированноч водой. Прибавляют индикатор ( смесь мурексида с NaCl) и тотчас титруют раствором ЭДТА до перехода окраски в фиолетовую. Рассчитывают количество Са2 в митохондриях печени крысы и его изменения в ходе инкубации в различных условиях. Полученные результаты оформляют в виде таблицы. [36]
Получают митохондрии печени крысы согласно описанию на с. В другой пробе в среду инкубации вносят суспензию митохондрий ( 3 - 5 мг белка на 1 мл пробы), 5 мкМ ротенон и регистрируют в течение 1 - 2 мин концентрацию К во внешней среде. В пробу добавляют валиномицин ( около 0 1 нмоль на 1 мг белка), измеряют концентрацию ионов К во внешней среде и рассчитывают скорость его диффузии в стационарном состоянии. Внесением 2 4-динитрофенола ( 100 мкМ) индуцируют выход ионов К во внешнюю среду. Изменения концентрации К в среде рассчитывают по калибровочной кривой. [37]
После инкубации срезы отмывают средой инкубации ( без меченых нейромедиаторов) и переносят на полиэтиленовые сетки перфузионных камер объемом 0 5 мл, помещая между двумя платиновыми электродами. Срезы перфуэируют раствором следующего состава ( ммоль / л): NaCl - 122; К. CaClj 1 3; MgS04 - 1 2; КН2РО4 0 4; NaHCO3 - 25; глюкоза - 10; аскорбиновая кислота - 1 14; ниаламид 0 01 ( рН среды 7, 4); скорость перфузии Q. Пятиминутные порции перфузата обирают через 30 мин от начала перфузии, т.е. с момента установле ния плато спонтанного выхода радиоактивной метки. [38]
Скорости потребления кислорода определяют полярографически ( с. Ячейку полярографа заполняют 2 мл среды инкубации ( см. выше), погружают электроды и в реакционную смесь вносят 0 08 - 0 10 мл густой суспензии митохондрий. Каждую пробу повторяют дважды. [39]
Оценивают концентрацию примесного Са2 в среде инкубации. [40]
Основным источником энергии для эритроцитов является глюкоза. Для оценки трансмембранного переноса определяют убыль глюкозы из среды инкубации, содержащей эритроциты. [41]
 |
Содержание ДНК и белка в супернатантах и растворах ДНП в 1 мМ трис - НСЛ буфере после депротеинизации трипсином. [42] |
ДНП из спермы, по-видимому, объясняется меньшей дозой мутагена. Существенным итогом действия НММ на ДНП в составе ядер является увеличение его выхода в среду инкубации примерно в 4 раза. Это может быть не только результатом прямого действия НММ на ДНП, но и результатом ее действия на ядерные мембраны. [43]
Перед определением активности готовится среда инкубации и делается необходимое разведение протеинкиназы. Разведение фермента проводят в отдельных пробах так, чтобы в 20 мкл раствора содержалось по 10, 20, 30, 40, 50 мкг белка соответственно. Среду инкубации раскапывают по 95 мкл в инкубационные пробирки. [44]
Адсорбцию ( иммобилизацию) гексокиназы на липосомах проводят сус-пендированием препарата липосом ( 3 мг лецитина) в 1 мЛ раствора фермента, содержащего различные количества единиц используемого фермента, а также 15 мМ MgCl2 или 5 мМ глюкозу в качестве адсорбирующих реагентов. Контрольная проба адсорбирующих реагентов не содержит. После 30-минутной инкубации при 0 С мембраны, содержащие адсорбированную гексокиназу, отделяют центрифугированием при 100 000 g в течение 1 ч и суспендируют в среде инкубации. Препарат иммобилизованной гексокиназы используют для изучения свойств в день получения. [45]
Страницы: 1 2 3 4