Cтраница 4
Для выравнивания объемов в первые 6 проб ( варианты 1 и 2) следует добавить по 0 1 мл воды. Однако при такой постановке эксперимента, строго говоря, не обеспечиваются одинаковые условия взаимодействия фермента с модификатором в вариантах 3 и 4 из-за их концентраций в момент контакта и на первых этапах взаимодействия. Поэтому следует предусмотреть и такую постановку эксперимента, когда в варианте 4 алик-вота фермента ( 0 1 мл) разводится 0 5 М КС1 до 1 мл, затем сюда добавляется 0 1 мл раствора ДНФ и после 0 1 мл среды инкубации, в 10 раз более концентрированной, чем в трех первых вариантах. В результате эксперимента убеждаются в том, что: а) модифицирующий реагент ( ДНФ) вызывает инактивацию фермента в отсутствие субстрата и что субстрат защищает фермент от инактивации; б) активирующее действие ДНФ на АТФазную активность миозина проявляется только в присутствии АТФ. [46]
Концентрация свободного Са2 - - в среде в таких условиях составляет - 10 мкМ, что достаточно для полной активации Са-АТФазы. Время инкубации составляет 0 5 - 15 мин и подбирается с учетом линейности реакции во времени. Реакцию останавливают добавлением 1 мл охлажденного 3 М ацетатного буфера ( рН 4 3) и определяют неорганический фосфат по методу Ратбуна и Ветлах ( с. Активность Mg-АТФазы определяют в той же среде в отсутствие добавки СаСЬ - Активность Са-АТФазы рассчитывают как разность между общей АТФ-азной активностью и активностью Mg-АТФазы При работе с аккумулирующими Са2 препаратами СР в среду инкубации вводят 5 мМ ок-салат калия для увеличения емкости везикул. [47]
Результаты опытов по выявлению специфичности и некоторых свойств АТФ-азы сетчатки показали, что при замене в среде инкубации АТФ на АМФ активность фермента в ядрах ганглиозных клеток, кровеносных сосудах и глиальных элементах сетчатки значительно снижается, но полностью не исчезает. АТФ-аза нейронов наружного и внутреннего ядерных слоев не активировалась динитрофенолом и угнеталась АДФ. Во всех клеточных элементах и в сосудах сетчатки основная часть выявляемой активности АТФ-азы зависела от наличия магния в среде инкубации и лишь незначительная часть ее, локализованная преимущественно в структурах ядер ядерных слоев, не зависела от присутствия магния. В ганглиозных клетках Mg, зависимая АТФ-аза была приурочена в основном к ядрышку, хро-матиновой зернистости и оболочке клетки и ядра. В нейронах наружного и внутреннего ядерных слоев Mg зависимая АТФ-аза в большей степени была приурочена к оболочке и в меньшей к внутриядерным структурам. [48]
Для определения константы скорости инактивации Са - АТФазы НБД-хлоридом проводят модификацию SH-групп в той же среде, которая используется для определения кинетических характеристик SH-групп ( с. Реакцию начинают добавлением НБД-хлорида. По ходу реакции каждые 0 5 - 5 мин в зависимости от условий реакции отбирают аликвоты объемом 20 - 50 мкл и вносят их в 1 мл среды для определения активности Са - АТФазы ( с. Образующийся неорганический фосфат определяют методом Ратбуна и Ветлах ( с. Объем отбираемой пробы и время инкубации при определении активности подбирают заранее Ингибирующим действие НБД-хлорида в ходе измерения активности фермента можно пренебречь, учитывая разведение ингибитора и высокую концентрацию АТФ в среде инкубации. [49]
Отмытые и подсушенные с помощью кусочка фильтровальной бумаги электроды полярографа осторожно опускают в кювету, заполненную 2 мл среды 1 ( проба 1) до полного выхода пузырька воздуха. В течение 40 - 60 с регистрируют медленное эндогенное дыхание и добавляют 0 02 мл сукцината ( 10 мМ), который вызывает небольшую стимуляцию дыхания. При этом дыхание сначала резко активируется, затем быстро снижается до исходного уровня. Добавку повторяют несколько раз до тех пор, пока стимуляция дыхания после каждого добавления сменяется четко выраженным торможением. Учитывая количество добавленного СаС12, оценивают его максимальную концентрацию, вызывающую обратимую стимуляцию дыхания. В пробе 2 убеждаются в том, что выбранная концентрация СаС12 вызывает обратимую стимуляцию дыхания с отчетливым выходом в контролируемое состояние. Для определения величины АДФ / О записывают следующую пробу. С этой целью в кювету со средой последовательно добавляют митохондрии, сукцинат и АДФ в концентрации от 300 до 400 мкМ ( определение АДФ / О см. на с. В этом случае целесообразно уменьшить концентрацию добавляемого СаС12 в 1 5 - 2 раза, а в среду инкубации предварительно добавить ( непосредственно в кювету) 1 мМ НАД для предотвращения утечки эндогенных пиридиннуклеотидов. [50]