Cтраница 1
Среда выделения: 50 мМ трис - HCl буфер, рН 7 5, содержащий 1 мМ ЭДТА. [1]
Добавляют среду выделения из расчета 5 мл среды на 1 г ткани и гомогенизируют в течение 30 с с помощью тефлонового пестика без нарезки. Полученный гомогенат центрифугируют при 20 000 g в течение 15 мин. Супернатант представляет собой 16 % - ную растворимую клеточную фракцию. Препарат фильтруют через 4 слоя марли и хранят порциями при - 5 С в течение 2 нед. Размораживание растворимой клеточной фракции проводят при комнатной температуре. [2]
В хромовокислой среде выделения на катоде практически не наблюдается. Выделение происходит лишь на аноде при потенциале выше ( 1 08 0 03) в, что уже ранее наблюдалось в азотно -, серно-и уксуснокислой средах. [3]
Печень дважды промывают охлажденной средой выделения и помещают в чашку Петри, стоящую на льду. После измельчения ножницами кусочки печени снова дважды промывают охлажденной средой выделения. [4]
Изолированную печень погружают в 30 мл ледяной среды выделения. После двух-трехкратного промывания ткань измельчают ножницами на чашке Петри, стоящей на льду. Кашицу вновь помещают в стаканчик со свежей средой выделения и тщательно промывают. После оседания кусочков ткани на дно жидкость осторожно сливают и промывание повторяют еще дважды. Ткань переносят в гомогенизатор, добавляют 40 мл среды выделения и измельчают в течение 30 - 40 с. К гомогенату добавляют 40 мл среды выделения, перемешивают медленно вращающимся пестиком и разливают его в два центрифужных стакана. Центрифугируют в течение 10 мин при 0 - 2 С при 600 g для удаления обломков клеток и ядерной фракции. [5]
Полученную фракцию клеточных мембран суспендируют в среде выделения без сахарозы и MgCl2 до концентрации белка 4 мг / мл. [6]
Поверхность полученного осадка митохондрий дважды ополаскивают 2 мл среды выделения для удаления верхнего рыхлого слоя, содержащего примесь саркоплазматического ретикулума. Внутренние стенки стакана осторожно подсушивают фильтровальной бумагой. К осадку добавляют среду выделения из расчета 0 05 мл на 2 г ткани для полярографических исследований или 0 4 мл - для манометрических. Осадок суспендируют с помощью пипетки и переносят в маленький центрифужный стакан, где митохондрии осторожно растирают пестиком до гомогенного состояния. [7]
Когда промывные воды приобретают слабо-розовую окраску, мышечную массу ополаскивают средой выделения и отфильтровывают в последний раз. Супернатант вместе с верхним рыхлым слоем осадка сливают, плотный осадок митохондрий суспендируют в 0 25 М сахарозе при помощи стеклянного гомогенизатора с тефлоновым пестиком и переосаждают в тех же условиях. Полученные митохондрии суспендируют в 0 25 М сахарозе в гомогенизаторе до конечной концентрации белка 50 - 60 мг / мл ( объем 15 - 20 мл), замораживают при - 20 С и используют в дальнейшем для получения субмитохондриальных частиц. [8]
Мышцы спины и задних конечностей декапитированной крысы помещают в стакан с охлажденной средой выделения. Через 10 мин их вынимают по одной на чашку Петри, обсушивают фильтровальной бумагой, очищают от жира и соединительной ткани и тщательно измельчают ножницами в кашицу. Навеску этой массы ( 3 - 5 г) берут на технохимических весах в фарфоровой чашке, предварительно взвешенной и стоящей во льду, и делят ее на 2 - 3 части для порционного гомогенизирования. Порцию кашицы переносят в охлажденный стеклянный стакан гомогенизатора Поттера с тефлоновым пестиком, добавляют 5 объемов среды выделения ( на 1 г ткани 5 мл), перемешивают стеклянной палочкой и гомогенизируют 1 - 2 мин. Гомогенат сливают в стакан. Процедуру повторяют со следующими порциями; гомогенаты объединяют. [9]
Мышцы ( - 5 г) задних конечностей декапитированного животного помещают в ледяную среду выделения. После охлаждения ткань обсушивают фильтровальной бумагой, переносят в чашку Петри, стоящую на льду, очищают от жира и соединительной ткани, измельчают ножницами. Навеску тканевой кашицы гомогенизируют в стеклянном гомогенизаторе Поттера с тефлоновым пестиком, имеющим нарезку в 6-кратном по отношению к весу ткани объеме среды выделения. Тканевый гомогенат центрифугируют при 15000 g в течение 20 мин. Су-пернатант после центрифугирования, представляющий собой 14 % - нук растворимую клеточную фракцию, фильтруют через 4 слоя марли и хранят порциями при - 5 С в течение 2 нед. [10]
Для выделения ядер проводили предварительную методическую работу по выбору способна разрушения клеток, среды выделения, очистки полученных клеточных фракций. [11]
В три стакана ( объемом 100, 50 и 50 мл) наливают по 30 мл среды выделения, охлажденной до 0 С. Среда гомогенизации должна содержать соли, так как в растворе сахарозы или других неэлектролитов миофибриллы желатинируются и плохо разрушаются. Первый стакан ( на 100 мл) взвешивают, второй ( на 50 мл) помещают в замораживающий холодильник, чтобы в жидкости появились кристаллы льда. [12]
Супернатант осторожно сливают и хранят на льду, осадки объединяют и вновь гомогенизируют 20 с в 20 мл среды выделения. Гомо-генат центрифугируют при 600 g 10 мин, супернатант объединяют с полученным ранее. [13]
Для выполнения некоторых работ гомогенизацию заменяют растиранием мышечной кашицы в ступке с кварцевым песком и с 2 - 3 объемами среды выделения в течение 30 мин. При такой грубой обработке митохондрии разрушаются, однако окислительные процессы и даже окислительное фосфорилирование могут идти за счет обломков митохондрий. [14]
Среда выделения: калий-фосфатный буфер - 0 05 М раствор, рН 7 6; рН буфера проверяют на потенциометре или с универсальным индикатором буферным методом. Всю посуду перед работой необходимо охладить на льду. [15]