Cтраница 2
Добавляют среду выделения из расчета 9 мл среды на 1 г ткани и гомогенизируют в течение 30 с с помощью тефлонового пестика без нарезки. Полученный гомогенат центрифугируют при 20 000 g в течение 15 мин. Супернатант после центрифугирования представляет собой 10 % - ную растворимую клеточную фракцию. Препарат фильтруют через 4 слоя марли и хранят порциями при - 5 С в течение 2 нед. Размораживание растворимой клеточной фракции проводят при комнатной температуре. [16]
Печень дважды промывают охлажденной средой выделения и помещают в чашку Петри, стоящую на льду. После измельчения ножницами кусочки печени снова дважды промывают охлажденной средой выделения. [17]
Поверхность полученного осадка митохондрий дважды ополаскивают 2 мл среды выделения для удаления верхнего рыхлого слоя, содержащего примесь саркоплазматического ретикулума. Внутренние стенки стакана осторожно подсушивают фильтровальной бумагой. К осадку добавляют среду выделения из расчета 0 05 мл на 2 г ткани для полярографических исследований или 0 4 мл - для манометрических. Осадок суспендируют с помощью пипетки и переносят в маленький центрифужный стакан, где митохондрии осторожно растирают пестиком до гомогенного состояния. [18]
Навеску ткани гомогенизируют ( приготовление препарата см. на с. Пот-тера в 5-кратном объеме среды выделения следующего состава: 0 01 М трис-буфер ( рН 7 6), 0 02 М MgCl2 и 0 05 М сахароза. Гомогенат центрифугируют на холоде при 18000 g в течение 30 мин. Центрифугат сливают в колбу, осадок суспендируют в таком же объеме среды выделения и повторяют гомогенизацию. Гомогенат центрифугируют, осадок отбрасывают, а центрифугах объединяют с первым. Объединенный раствор подвергают ультрацентрифугированию при 105000 g в течение 90 мин. [19]
Тканевый гомогенат центрифугируют при 600g в течение 10 мин для удаления ядер и обломков клеток. Полученный супернатант фильтруют через 4 слоя марли и центрифугируют при 10 000 g в течение 10 мин. Полученный осадок митохондрий промывают средой выделения от примеси растворимой клеточной фракции. Затем суспензию разводят средой выделения в 10 раз и центрифугируют при 10 000 g в течение 10 мин. Полученную фракцию промытых нативных митохондрий окончательно суспендируют в нужной среде из расчета: митохондрии из 1 г ткани в 5 мл среды Фракцию нативных митохондрий ( в 0 25 М сахарозе, рН 7 5) хранят при 0 С и используют в день выделения. [20]
Изолированную печень погружают в 30 мл ледяной среды выделения. После двух-трехкратного промывания ткань измельчают ножницами на чашке Петри, стоящей на льду. Кашицу вновь помещают в стаканчик со свежей средой выделения и тщательно промывают. После оседания кусочков ткани на дно жидкость осторожно сливают и промывание повторяют еще дважды. Ткань переносят в гомогенизатор, добавляют 40 мл среды выделения и измельчают в течение 30 - 40 с. К гомогенату добавляют 40 мл среды выделения, перемешивают медленно вращающимся пестиком и разливают его в два центрифужных стакана. Центрифугируют в течение 10 мин при 0 - 2 С при 600 g для удаления обломков клеток и ядерной фракции. [21]
Мышцы ( - 5 г) задних конечностей декапитированного животного помещают в ледяную среду выделения. После охлаждения ткань обсушивают фильтровальной бумагой, переносят в чашку Петри, стоящую на льду, очищают от жира и соединительной ткани, измельчают ножницами. Навеску тканевой кашицы гомогенизируют в стеклянном гомогенизаторе Поттера с тефлоновым пестиком, имеющим нарезку в 6-кратном по отношению к весу ткани объеме среды выделения. Тканевый гомогенат центрифугируют при 15000 g в течение 20 мин. Су-пернатант после центрифугирования, представляющий собой 14 % - нук растворимую клеточную фракцию, фильтруют через 4 слоя марли и хранят порциями при - 5 С в течение 2 нед. [22]
У только что декапитированной крысы быстро вырезают мышцы задних конечностей, стараясь их не повредить, и помещают их в стакан с переохлажденной средой. После очистки всех кусочков ткани их обсушивают фильтровальной бумагой и тщательно измельчают. Кашицу переносят в первый стакан и определяют чистый вес ткани. Добавляют среду выделения в таком количестве, чтобы общий объем ее в 4 раза превышал объем ткани. Смесь измельчают в гомогенизаторе 1 мин, поднимая и опуская пестик. [23]
Тканевый гомогенат центрифугируют при 600g в течение 10 мин для удаления ядер и обломков клеток. Полученный супернатант фильтруют через 4 слоя марли и центрифугируют при 10 000 g в течение 10 мин. Полученный осадок митохондрий промывают средой выделения от примеси растворимой клеточной фракции. Затем суспензию разводят средой выделения в 10 раз и центрифугируют при 10 000 g в течение 10 мин. Полученную фракцию промытых нативных митохондрий окончательно суспендируют в нужной среде из расчета: митохондрии из 1 г ткани в 5 мл среды Фракцию нативных митохондрий ( в 0 25 М сахарозе, рН 7 5) хранят при 0 С и используют в день выделения. [24]
Поттера и гомогенизируют в 5 объемах среды ( по отношению к весу ткани) в течение 1 мин, используя тефлоновый пестик без нарезки. Гомогенат центрифугируют при 15 000 g в течение 10 мин для осаждения ядер, обломков клеток и митохондрий. Полученный супернатант фильтруют через 4 слоя марли. Осадок макросом отмывают средой выделения от примеси растворимой клеточной фракции. С этой целью его суспендируют с помощью пипетки в небольшом объеме среды выделения ( микросомы из 1 г ткани в 0 2 мл среды), затем объем суспензии разводят в 20 раз и центрифугируют в указанных выше условиях. Полученную фракцию промытых микросом окончательно суспендируют в среде выделения из расчета: микросомы из 1 г ткани в 1 мл среды. [25]
Мышцы спины и задних конечностей декапитированной крысы помещают в стакан с охлажденной средой выделения. Через 10 мин их вынимают по одной на чашку Петри, обсушивают фильтровальной бумагой, очищают от жира и соединительной ткани и тщательно измельчают ножницами в кашицу. Навеску этой массы ( 3 - 5 г) берут на технохимических весах в фарфоровой чашке, предварительно взвешенной и стоящей во льду, и делят ее на 2 - 3 части для порционного гомогенизирования. Порцию кашицы переносят в охлажденный стеклянный стакан гомогенизатора Поттера с тефлоновым пестиком, добавляют 5 объемов среды выделения ( на 1 г ткани 5 мл), перемешивают стеклянной палочкой и гомогенизируют 1 - 2 мин. Гомогенат сливают в стакан. Процедуру повторяют со следующими порциями; гомогенаты объединяют. [26]
Изолированную печень погружают в 30 мл ледяной среды выделения. После двух-трехкратного промывания ткань измельчают ножницами на чашке Петри, стоящей на льду. Кашицу вновь помещают в стаканчик со свежей средой выделения и тщательно промывают. После оседания кусочков ткани на дно жидкость осторожно сливают и промывание повторяют еще дважды. Ткань переносят в гомогенизатор, добавляют 40 мл среды выделения и измельчают в течение 30 - 40 с. К гомогенату добавляют 40 мл среды выделения, перемешивают медленно вращающимся пестиком и разливают его в два центрифужных стакана. Центрифугируют в течение 10 мин при 0 - 2 С при 600 g для удаления обломков клеток и ядерной фракции. [27]
Поттера и гомогенизируют в 5 объемах среды ( по отношению к весу ткани) в течение 1 мин, используя тефлоновый пестик без нарезки. Гомогенат центрифугируют при 15 000 g в течение 10 мин для осаждения ядер, обломков клеток и митохондрий. Полученный супернатант фильтруют через 4 слоя марли. Осадок макросом отмывают средой выделения от примеси растворимой клеточной фракции. С этой целью его суспендируют с помощью пипетки в небольшом объеме среды выделения ( микросомы из 1 г ткани в 0 2 мл среды), затем объем суспензии разводят в 20 раз и центрифугируют в указанных выше условиях. Полученную фракцию промытых микросом окончательно суспендируют в среде выделения из расчета: микросомы из 1 г ткани в 1 мл среды. [28]
Навеску ткани гомогенизируют ( приготовление препарата см. на с. Пот-тера в 5-кратном объеме среды выделения следующего состава: 0 01 М трис-буфер ( рН 7 6), 0 02 М MgCl2 и 0 05 М сахароза. Гомогенат центрифугируют на холоде при 18000 g в течение 30 мин. Центрифугат сливают в колбу, осадок суспендируют в таком же объеме среды выделения и повторяют гомогенизацию. Гомогенат центрифугируют, осадок отбрасывают, а центрифугах объединяют с первым. Объединенный раствор подвергают ультрацентрифугированию при 105000 g в течение 90 мин. [29]
Изолированную печень погружают в 30 мл ледяной среды выделения. После двух-трехкратного промывания ткань измельчают ножницами на чашке Петри, стоящей на льду. Кашицу вновь помещают в стаканчик со свежей средой выделения и тщательно промывают. После оседания кусочков ткани на дно жидкость осторожно сливают и промывание повторяют еще дважды. Ткань переносят в гомогенизатор, добавляют 40 мл среды выделения и измельчают в течение 30 - 40 с. К гомогенату добавляют 40 мл среды выделения, перемешивают медленно вращающимся пестиком и разливают его в два центрифужных стакана. Центрифугируют в течение 10 мин при 0 - 2 С при 600 g для удаления обломков клеток и ядерной фракции. [30]