Cтраница 4
На пластинке Фиксион 50x8 изомеры-трипептиды Гли-L - Ала - Ь - Лей и Гли-О - Ала - Ь - Лей разделяются довольно хорошо. Хроматографируют при комнатной температуре до высоты 12 - 15 см. Если требуется количественно определить степень рацемизации ( с точностью 5 - 10 %), применяют денситомет-рию тонкослойных хроматограмм. Для получения более точных результатов целесообразно воспользоваться автоматическим анализатором. [46]
Сначала рассмотрим случай, в котором реакция замещения происходит у оптического центра, например, реакцию гидрогенолиза: RR R CBr - RR R CH. Ясно, что в этом случае для того, чтобы определить, протекает ли реакция с обращением или с сохранением конфигурации, нужно знать механизм реакции. В том случае, когда замещение не обязательно затрагивает оптический центр, можно получить данные о степени рацемизации, если, конечно, таковая будет иметь место. [47]
Основной вывод этих исследований заключается в том, что методы дают незначительную степень рацемизации или вообще ее не дают при условии использования защитных групп уретано-вого типа, таких, как карбобензоксигруппа. Исключение составляют методы цианметиловых эфиров и тиофениловых эфиров в ледяной уксусной кислоте, дающие соответственно 2 и 29 % рацемизации. Напротив, всем методам с N-ацильными защитными группами, подобными N-трифторацетильной, за исключением азидного и метода виниловых эфиров, присуща большая или меньшая рацемизация. Степень рацемизации зависит от растворителей, температуры реакции и метода присоединения метилового эфира L-валина. Степень рацемизации меньше, если добавляется свободный эфир, а не эфир, полученный из хлоргидрата действием триэтиламина, так как в растворе всегда частично остается хлоргидрат триэтиламина, количество которого зависит от природы растворителя. На основании высокой степени рацемизации, обнаруженной при добавлении имидазола или N-бен-зилимидазола в карбодиимидном методе, сделан вывод о том, что синтез гистидинсодержащих пептидов должен проводиться только с ациламинокислотами уретанового типа или азидным методом с N-ацилпептидами. [48]
Обратное превращение таутомера ( 1106) в азлактон происходит нестереоселектив-но и приводит к рацемизации аминокислотного остатка. Это особенно опасно при твердофазном синтезе, так как в этом случае не используются промежуточные стадии очистки и происходит постоянное накопление диастереомеров в растущей полипептидной цепи. Не существует способов, позволяющих целиком избежать рацемизации. Однако ряд активирующих процедур позволяет снизить степень рацемизации. Наилучшие результаты достигаются использованием ДЦК в смеси с нуклеофильным катализатором, например гидроксибензотриазолом. В этом случае N-ацетиламинокислота ( чаще всего Вос-аминокислота) превращается in situ в активированный эфир, который существенно меньше склонен к образованию азлактона. [49]
Полимерная мочевина, получающаяся в результате реакции, легко удаляется. Ито и др. [302] предложили несимметричные карбодиимиды, N-атомы которых имеют различную электронную плотность, и поэтому при пептидном синтезе снижается нежелательная О - N-миграция ацильной группы, ведущая к N-ацилмочевине. При применении 1-бензил - З - этилкарбодиимида заметно снижается образование N-ацилмочевины. Кроме того, следует указать на гораздо меньшую по сравнению с ДЦГК степень рацемизации, определенную по тесту Янга ( разд. [50]
Степень рацемизации при реакциях конденсации с М - защи-щенными аминокислотами зависит главным образом от природы используемой N-защитной группы. Блокирование аминогруппы такими защитными группировками ацильного типа, как фор-мильная или трифторацетильная, способствует рацемизации, так как в этом случае очень легко образуются азлактоны. Остатки оптически активных С-концевых аминокислот в М - защи-щенных пептидах рацемизуются почти во всех случаях. Воган [2363] детально изучил реакцию конденсации Cbo-Gly-L-Phe-OH с этиловым эфиром глицина при различных условиях; при этом, в частности, было установлено, что наибольшее влияние на степень рацемизации оказывает природа растворителя. Так, в хлороформе наблюдается полная рацемизация, в тетрагидрофуране рацемизации не обнаружено вообще, а в диоксане она достигает 10 %; степень рацемизации в смеси толуола с хлороформом возрастает с увеличением относительного содержания хлороформа. Более того, было найдено, что степень рацемизации зависит от времени реакции образования смешанного ангидрида: увеличение продолжительности реакции ведет к большей рацемизации. С другой стороны, температура в процессе реакции конденсации с эфирами аминокислот не оказывает столь существенного влияния на процесс рацемизации. Эти наблюдения нашли подтверждение в исследованиях Детерманна и Виланда [ 590а ], которые на том же самом примере показали, что рацемизации не происходит во время образования смешанного ангидрида в тетрагидрофуране при - 15 и при последующей конденсации с амино-эфиром в течение 10 мин. Рацемизация аминокомпонента при конденсации карбобензо-ксиглицина с L-триптофаном в водно-щелочном растворе обнаружена Инглом [1089]; обычно же аминокомпонент не рацеми-зуется. [51]
Степень рацемизации при реакциях конденсации с М - защи-щенными аминокислотами зависит главным образом от природы используемой N-защитной группы. Блокирование аминогруппы такими защитными группировками ацильного типа, как фор-мильная или трифторацетильная, способствует рацемизации, так как в этом случае очень легко образуются азлактоны. Остатки оптически активных С-концевых аминокислот в М - защи-щенных пептидах рацемизуются почти во всех случаях. Воган [2363] детально изучил реакцию конденсации Cbo-Gly-L-Phe-OH с этиловым эфиром глицина при различных условиях; при этом, в частности, было установлено, что наибольшее влияние на степень рацемизации оказывает природа растворителя. Так, в хлороформе наблюдается полная рацемизация, в тетрагидрофуране рацемизации не обнаружено вообще, а в диоксане она достигает 10 % - степень рацемизации в смеси толуола с хлороформом возрастает с увеличением относительного содержания хлороформа. Более того, было найдено, что степень рацемизации зависит от времени реакции образования смешанного ангидрида: увеличение продолжительности реакции ведет к большей рацемизации. С другой стороны, температура в процессе реакции конденсации с эфирами аминокислот не оказывает столь существенного влияния на процесс рацемизации. Эти наблюдения нашли подтверждение в исследованиях Детерманна и Виланда [ 590а ], которые на том же самом примере показали, что рацемизации не происходит во время образования смешанного ангидрида в тетрагидрофуране при - 15 и при последующей конденсации с амино-эфиром в течение 10 мин. Рацемизация аминокомпонента при конденсации карбобензо-ксиглицина с L-триптофаном в водно-щелочном растворе обнаружена Инглом [1089]; обычно же аминокомпонент не рацеми-зуется. [52]