Столбик - гель
Cтраница 2
Состав растворов I-V приведен в тексте. Приведенные объемы конечных растворов достаточны для приготовления 16 столбиков геля размером 0 5X7 см. aSDS - додецилсульфат натрия. [16]
Вискозную губку 5, расположенную на анодной пластине 6, тщательно насыщают 70 % - ной уксусной кислотой. На верхней стороне губки расположен гребнеобразный сепаратор 4, в который вставляют столбики геля. Поверх образцов геля помещают другую вискозную губку и накрывают ее целлофановой пленкой, на которую ставят катодную пластину. Все эти слои скрепляют тонкими резинками; проделать это следует очень осторожно, так как иначе можно выжать жидкость из губки. Чтобы прибор работал нормально, столбики геля должны контактировать с источником питания с двух сторон; при этом они не должны выступать из блока. Через 25 - 40 мин работы прибор выключают, разъединяют и столбики геля вставляют в пробирки с 7 % - ной уксусной кислотой. Используемая вискозная губка должна быть мелкопористой и однородной. Если плотность тока увеличивается или обесцвечивание проводится слишком долго, может происходить частичное высушивание или окрашивание геля. Если данная вискозная губка всегда помещается у одного и того же электрода, ее не нужно отмывать после процесса обесцвечивания, а достаточно просто выжать. [17]
 |
Денситометрическая запись смещения интерференционных полос. [18] |
Если толщина белковой зоны везде одинакова, а концентрация белка по всей зоне постоянна и если столбик геля имеет правильную цилиндрическую форму, то расчет содержания белка в белковой зоне, производимый на основании регистрации по линии Л - В-С, сделать очень легко. Однако если белковая зона имеет линзообразную форму или поперечное сечение не является правильной окружностью, а белок внутри зоны распределен неравномерно, то приходится делать 3 - 4 записи вдоль геля. Тогда мы получим распределение количества белка по всей зоне. [19]
Поскольку максимальная скорость потока на агарозе сравнительно низка, не рекомендуется применять очень длинные колонки. Эти ограничения не касаются сефарозы ( Sepharose, фирма Pharmacia) и биогеля А, которые настолько эластичны, что столбик геля сжимается при увеличении скорости потока. Эти гели необходимо оберегать от контакта с органическими растворителями или другими денатурирующими агентами ( например, мочевиной), поскольку в таком случае структура геля необратимо нарушается. При применении высококонцентрированных солевых растворов следует на небольшой пробе предварительно убедиться в том, что они не разрушают гель. Для предохранения геля от зарастания в элюент всегда следует вводить 0 02 % азида натрия. [20]
Все описанные позднее варианты ( табл. 15) используют методику, предложенную Иоганссоном и Римо [87], которые впервые описали открытый столбик геля. [21]
Выбор типа геля определяется молекулярным весом пептидов, входящих в состав смеси. Вещества, молекулярный вес которых превышает предел эксклюзии, элюируются в свободном объеме; низкомолекулярные примеси элюируются в объеме, примерно равном столбику геля. Разделяются лишь те компоненты смеси, молекулярный вес которых лежит в пределах рабочей области геля. [22]
При разделении белков методом ГПХ компоненты смеси могут иметь очень близкие константы распределения / Cav. Для разделения подобных смесей можно, конечно, воспользоваться более длинной колонкой. Однако при увеличении столбика геля возрастает гидродинамическое сопротивление, а следовательно, падает скорость элюирования. В то же время нельзя допускать большого перепада давления, в особенности при работе на легко деформирующихся крупнопористых гелях, пригодных для разделения белков. [23]
Суспензию сефадексаО - 15 ( размер частиц 40 - 120 мкм) оставляют набухать в течение 2 суток в элюенте, после чего мелкие частицы удаляют декантацией. Суспензию набухшего геля дегазируют при пониженном давлении и переносят в колонку ( 1 5X60 или 1 5X90 см), частично заполненную элюентом. После того как образуется столбик геля высотой 5 см, открывают кран колонки и при скорости вытекания 30 мл / ч постепенно добавляют остальную суспензию геля. Общий объем столбика геля составляет 100 - 150 мл. [24]
 |
Разделение фентиона и пяти продуктов его метаболизма. [25] |
Методика заключается в следующем. Сефадекс LH-20 замачивают в течение 24 ч в ацетоне, тетрагидрофуране или этаноле. Суспензию геля помещают в стеклянную хроматографическую колонку ( диаметром 2 см), объем столбика геля составляет примерно 75 мл. В колонку вносят смесь пестицидов, содержащую в 1 мл по 20 мкг каждого компонента, и элюируют со скоростью подачи 1 мл / мин. Каждая смесь содержит до 5 пестицидов и всегда включает в качестве внутреннего стандарта паратион. [26]
Избегая образования пузырьков воздуха, эти углубления заполняют буферным раствором с помощью капиллярной пипетки. Электрический контакт между буферным раствором, содержащимся в верхнем резервуаре, и верхним концом столбика геля осуществляется за счет полоски фильтровальной бумаги соответствующей формы, смоченной буферным раствором. Исследуемую сыворотку ( или любую другую смесь белков) вносят в заполненные буферным раствором углубления верхней части геля, причем 0 03 мл сыворотки подслаивают на дно углубления, и она оказывается между гелем и буферным раствором, покрывающим гель до начала электрофореза. [27]
Аппарат для электрофореза подключают к соответствующим полюсам источника постоянного тока, учитывая величины изоэлектричес-ких точек разделяемых белков и рН буферной системы. При исследовании лабильных белков аппарат помещают в холодильник. После завершения электрофореза прибор отключают от источника тока, сливают буферный раствор, трубочки вынимают из прибора и с помощью стальной иглы ( под слоем воды) или водой, вводимой шприцом между поверхностью геля и стенкой трубочки, выталкивают столбик геля в 7 % - ный раствор уксусной кислоты. [28]
Суспензию сефадексаО - 15 ( размер частиц 40 - 120 мкм) оставляют набухать в течение 2 суток в элюенте, после чего мелкие частицы удаляют декантацией. Суспензию набухшего геля дегазируют при пониженном давлении и переносят в колонку ( 1 5X60 или 1 5X90 см), частично заполненную элюентом. После того как образуется столбик геля высотой 5 см, открывают кран колонки и при скорости вытекания 30 мл / ч постепенно добавляют остальную суспензию геля. Общий объем столбика геля составляет 100 - 150 мл. [29]
Методика работы была следующая. Например, смесь солей железа и меди хорошо разделяется осаждением этих катионов гидрофосфатом калия; при этом выпадают осадки фосфатов железа и меди соответственно. Вначале, в верхней части столбика геля, выпадает фосфат железа, затем следует прозрачный промежуток, и выпадает фосфат меди. Для четкого разделения нужно пользоваться в качестве осадителя гидрофосфатом калия, но не гидрофосфатом натрия. [30]
Страницы: 1 2 3