Столбик - гель
Cтраница 3
 |
Схема кинетометра. [31] |
При сетчатой структуре разбавленных гелей и студней, в которых содержание воды достигает 95 - 99 %, вещества с малой молекулярной массой, находящиеся в растворе, диффундируют примерно с такой же скоростью, как в воде. Для этого исследуемый гель или студень помещают в трубку 1, а в присоединенные к ней на шлифах трубки 2 и 3 наливают соответственно чистый растворитель и испытуемый раствор. По истечении определенного промежутка времени, разобрав прибор, вынимают из трубки / столбик геля или студня и определяют в нем содержание диффундирующего вещества. С характером диффузии в гелях и студнях связана и их электропроводность. [32]
Полное разделение суммарной рРНК обычно достигается через 1 - 2 ч электрофореза. Положение полос РНК можно определять прямым сканированием геля при помощи, например, УФ-сканнера фирмы Joyce-Loebl UV, или в случае радиоактивной РНК гель разрезают и определяют радиоактивность полученных срезов. По-видимому, наиболее продолжительной стадией является локализация компонентов РНК окрашиванием; если не использовать электрический отмывающий прибор ( например, типа Ccmalco, Inc. Однако эта продолжительная операция компенсируется тем, что можно одновременно обрабатывать десять и более столбиков геля. [33]
Вискозную губку 5, расположенную на анодной пластине 6, тщательно насыщают 70 % - ной уксусной кислотой. На верхней стороне губки расположен гребнеобразный сепаратор 4, в который вставляют столбики геля. Поверх образцов геля помещают другую вискозную губку и накрывают ее целлофановой пленкой, на которую ставят катодную пластину. Все эти слои скрепляют тонкими резинками; проделать это следует очень осторожно, так как иначе можно выжать жидкость из губки. Чтобы прибор работал нормально, столбики геля должны контактировать с источником питания с двух сторон; при этом они не должны выступать из блока. Через 25 - 40 мин работы прибор выключают, разъединяют и столбики геля вставляют в пробирки с 7 % - ной уксусной кислотой. Используемая вискозная губка должна быть мелкопористой и однородной. Если плотность тока увеличивается или обесцвечивание проводится слишком долго, может происходить частичное высушивание или окрашивание геля. Если данная вискозная губка всегда помещается у одного и того же электрода, ее не нужно отмывать после процесса обесцвечивания, а достаточно просто выжать. [34]
Тип геля выбирают так, чтобы пептид появлялся на выходе колонки вблизи свободного объема. Для этой цели наиболее всего подходят сефадексы G-10, Q-15, G-25 и биогели Р-2 и Р-6. Элюиро-вать удобно летучими буферными растворами, хотя выбор буфера зависит от растворимости пептида. В случае необходимости обессоливание ведут в дистиллированной воде, однако при этом происходит расширение зон, которое может привести к их перекрыванию. Для достижения полного обессоливания необходимо увеличить столбик геля. Пептиды обнаруживают в элюате колориметрически, спектрофото-метрически, а выделяют упариванием при пониженном давлении или лиофилизацией. [35]
Вискозную губку 5, расположенную на анодной пластине 6, тщательно насыщают 70 % - ной уксусной кислотой. На верхней стороне губки расположен гребнеобразный сепаратор 4, в который вставляют столбики геля. Поверх образцов геля помещают другую вискозную губку и накрывают ее целлофановой пленкой, на которую ставят катодную пластину. Все эти слои скрепляют тонкими резинками; проделать это следует очень осторожно, так как иначе можно выжать жидкость из губки. Чтобы прибор работал нормально, столбики геля должны контактировать с источником питания с двух сторон; при этом они не должны выступать из блока. Через 25 - 40 мин работы прибор выключают, разъединяют и столбики геля вставляют в пробирки с 7 % - ной уксусной кислотой. Используемая вискозная губка должна быть мелкопористой и однородной. Если плотность тока увеличивается или обесцвечивание проводится слишком долго, может происходить частичное высушивание или окрашивание геля. Если данная вискозная губка всегда помещается у одного и того же электрода, ее не нужно отмывать после процесса обесцвечивания, а достаточно просто выжать. [36]
Размер колонки 3x80 см. Сефадекс G-200 суспендируют в 0 1 М трис - HCl рН 8 0, содержащем 0 2 М NaCl, и на сутки оставляют для набухания. Мелкие плавающие в надосадочной жидкости частицы удаляют декантацией. На дно колонки кладут фильтр из бумаги или стеклянную вату и наполняют колонку на 1 / 3 высоты буферным раствором. Сначала в колонку вносят порцию сефадекса G-25, образующего слой высотой 2 см ( сефадекс G-25 должен быть предварительно оставлен на сутки в буферном растворе для набухания) Затем начинают заполнять колонку разбавленной суспензией сефадекса G-200 и через несколько минут оседания открывают выходное отверстие. По мере вытекания буферного раствора продолжают заполнение колонки суспензией сефадекса, следя за тем, чтобы образующиеся при заполнении пузырьки воздуха не задерживались в столбике геля. Когда образуется столбик геля требуемой высоты, через колонку пропускают один объем буферного раствора. [37]
Размер колонки 3x80 см. Сефадекс G-200 суспендируют в 0 1 М трис - HCl рН 8 0, содержащем 0 2 М NaCl, и на сутки оставляют для набухания. Мелкие плавающие в надосадочной жидкости частицы удаляют декантацией. На дно колонки кладут фильтр из бумаги или стеклянную вату и наполняют колонку на 1 / 3 высоты буферным раствором. Сначала в колонку вносят порцию сефадекса G-25, образующего слой высотой 2 см ( сефадекс G-25 должен быть предварительно оставлен на сутки в буферном растворе для набухания) Затем начинают заполнять колонку разбавленной суспензией сефадекса G-200 и через несколько минут оседания открывают выходное отверстие. По мере вытекания буферного раствора продолжают заполнение колонки суспензией сефадекса, следя за тем, чтобы образующиеся при заполнении пузырьки воздуха не задерживались в столбике геля. Когда образуется столбик геля требуемой высоты, через колонку пропускают один объем буферного раствора. [38]
Страницы: 1 2 3