Фактор - элонгация
Cтраница 3
Однако в столь упрощенной системе синтез идет медленно и весьма чувствителен к действию различных неблагоприятных факторов. Реально в клетках в синтезе белка на стадии элонгации участвуют два дополнительных белка, не входящих в состав рибосомы и называемых факторами элонгации. [31]
Сравнивая медленную бесфакторную транслокацию с быстрой EF-G GTP-катализируемой транслокацией, важно отметить, что фактор, по-видимому, не снижает заметным образом тепловую энергию активации процесса; это наводит на мысль, что здесь катализ имеет преимущественно энтропийную природу. Ингибиторный анализ также показывает, что фактор не создает нового реакционного пути, идущего через промежуточные стадии в обход высокого активационного барьера, как это делает обычный энтальпийный катализатор: самые различные специфические ингибиторы транслокации ( БИОМИЦИН, спектиномицин, эритромицин, неомицин, канамицин, гентамицин, гигромицин В) действуют как на энзиматический, так и неэнзиматический процесс, указывая на существование одинакового транслокационного механизма, с одними и, теми же мишенями в обоих случаях. Следовательно, фактор элонгации катализирует процесс, скорее всего, путем создания лучших пространственных условий в рибосоме для того же самого, присущего рибосоме как таковой, транслокационного пути. Одним из способов сделать это могла бы быть простая фиксация одного из термически флуктуирующих под-состояний рибосомы, которое было бы благоприятно для транслокации. Такой фиксирующий или ориентирующий эффект присоединения EF-G как крупного дополнительного лиганда рибосомы кажется вероятным. [32]
 |
Схема возможного расположения тРНК ( заштрихованная область в Р - участке рибосомы. [33] |
Это связывание происходит по другому тРНК - связывающему участку, который обозначается как А-участок. Сродство тРНК к А-участку приблизительно на порядок величины ниже, чем к Р - участку. Однако в процессе естественной трансляции связывание аминоацил-т РНК значительно усиливается участием белка ( фактора элонгации) EF-TU, который комплекси-руется с ней только при наличии свободной аминогруппы и сопровождает ее на первых стадиях. [34]
Другой подход, позволяющий контролировать развитие ВИЧ-инфекции, заключается в создании системы мечения ВИЧ-пораженных клеток для их специфического уничтожения. I отвечает за связывание с клеткой, II - за проникновение белка в клетку, III - за присоединение ADP-рибозы к эукарио-тическому фактору элонгации ( EF-2), что приводит к его инактивации. [35]
Элонгация представляет собой образование и удлинение полипептидной цепи, формирующейся на рибосоме. Этот процесс проходит при участии ГТФ и трех факторов элонгации. Эти факторы у прокариот имеют обозначения: EF-TU, EF-TS и EF-G, или просто: Tu, Ts и G. Фактор элонгации Ти образует комплекс с ГТФ, который связывается со всеми аминоацил-т РНК в цитоплазме. Ти обладает ГТФ-азной активностью и гидролизует ГТФ. После этого Ти, ГДФ и Рг удаляются из рибосомы и исходный комплекс регенерирует при помощи Ts и ГТФ. [36]
 |
Элементарный элонгационный цикл - считывание одного. [37] |
Когда пел-тидил - тРНК занимает Р - участок малой субъединицы, рибосома может связывать молекулу аминоацил-т РНК ( Аа - тРНК), соответствующую кодону, находящемуся в А-участке. Трансферазный центр на большой субъединице катализирует реакцию образования пептидной связи. После этого деацилированная тРНК выталкивается из рибосомы, а пептидил-т РНК перемещается в Р - участок. Связывание аминоацмл-т РНК катализируется фактором элонгации EF-1, с участием ГТФ, а транслокация - фавором элонгации EF-2 с ГТФ. Каждый шаг элонгации требует затраты ГТФ. Основная роль ГТФ - каталитическая, а не термодинамическая. [38]
Процесс элонгации принято делить на 3 стадии: узнавание кодона и связывание аминоацил-т РНК, образование пептидной связи и транслокация. На I стадии в соответствии с природой кодона мРНК в свободный А-участок рибосомы доставляется аминоацил-т РНК при участии фактора элонгации Tu. Этот процесс требует затраты энергии и сопряжен с гидролизом ГТФ и образованием прочно связанного комплекса Tu-ГТФ. Образовавшийся комплекс подвергается диссоциации только в присутствии второго фактора элонгации Ts, при котором освободившийся фактор Tu может вновь, соединяясь с молекулой ГТФ, принять участие в доставке аа-т РНК в рибосому. С этого момента начинается II стадия элонгации-образование первой пептидной связи. Для этого в рибосоме осуществляется ферментативная реакция транспептидирования между формилметионил-т РНК в П - центре и новой аа-т РНК в А-центре. В процессе этой реакции остаток формилметионина переносится на свободную NH2 - rpynny аа-т РНК и замыкается первая пептидная связь в будущей полипептидной цепи. Параллельно из пеп-тидильного центра освобождается тРНК Мет в цитозоль. Фермент, катализирующий реакцию транспептирования, получил название пептидил-трансферазы ( рис. 14.7); он, вероятнее всего, является составной частью белков 50S субчастицы. [39]
Было установлено, что при определенных условиях в бесклеточных системах транслокация может происходить также и в отсутствие факторов элонгации и ГТФ. Эта неэнзиматическая транслокация идет гораздо медленнее, чем EF-G GTP-катализируемая, но, тем не менее, дает в результате нормальное посттранслокационное состояние рибосомы, которое способно продолжать элонгацию. Следовательно, процесс транслокации является термодинамически спонтанным. Транслокационный механизм оказывается принципиально присущ самой рибосоме, а не привносится фактором элонгации. [40]
Для ферментативного действия А-субъединицы не нужно, по-видимому, ни NAD, ни других кофакторов; полагают, что ее действие может быть гидролитическим. Мишенью действия А-субъединицы являются 60S рибосомные субчастицы. Пока не известно, какого рода модификацию претерпевают рибосомные субчастицы; имеются косвенные данные, что именно белковый компонент 60S частиц как-то нарушается под действием энзиматической субъединицы токсина. Может быть, нарушение 60S субчастицы затрагивает ее функцию взаимодействия с факторами элонгации. Во всяком случае, сообщалось, что главным результатом действия токсина является ингибирование EF-2 - катализируемой транслокации. [41]
Вирусная инфекция эукариотической клетки часто приводит к снижению скорости элонгации всех полипептидов, синтезируемых хозяйскими рибосомами. Это явление общего замедления элонгации особенно характерно для пикорнавирусных инфекций; его наблюдали в клетках HeLa, инфицированных полиовирусом, в мышиных клетках асцитного рака Эрлиха, зараженных менговирусом, в L-клетках, инфицированных вирусом энцефаломиокардита. Считается, что пикор-навирусная инфекция ведет к снижению эффективности рибосом в элонгации. Имеются данные о том, что снижение элонгационной активности вызывается какими-то изменениями в рН 5 фракции, которая содержит аминоацил-т РНК-синтетазы, тРНК и факторы элонгации. [42]
Таким образом, в пептидильном центре локализуется формилметио-нин - тРНК, а в аминоацильном - тРНК, соединенная со следующей после ме-тионина аминокислотой. Следующим этапом элонгации является гидролиз сложноэфирной связи, перенос формилметионина из Р - центра в А-центр и образование пептидной связи. Этот процесс осуществляется при помощи фермента транспептид азы, входящей в состав 50S рибосомальной субъединицы. Находившаяся до этого в Р - центре тРНКШе1 отделяется от рибосомы и уходит в цитоплазму. Перемещение рибосомы по цепи мРНК происходит с помощью третьего фактора элонгации TF-G и требует затраты энергии ГТФ. Таким образом, завершается цикл элонгации, и белок-синтезирующая система готова к образованию следующей пептидной связи. [43]
Уже говорилось, что факторы терминации узнают терминирующий кодон, установленный именно в А-участке рибосомы. Прежде всего, кодонзависимое связывание RF возможно только после транслокации пептидил-т РНК из А-участка в Р - участок. В экспериментах in vitro можно прямо связать триплет AUG и инициатор-ную F-Met - tRNA с Р - участком вакантной рибосомы, а затем добавить RF и триплет UAA ( или UAG, или UGA); последние связываются и индуцируют гидролиз F-Met - tRNA в Р - участке с освобождением свободного формилметионина. Довольно очевидно, что в указанном случае терминирующий триплет и RF попадают в вакантный А-участок. Тот факт, что супрессорная аминоацил-т РНК с EF-TU и ГТФ, несущая антикодон, комплементарный терминирующему кодону, конкурирует с RF в процессе трансляции, тоже говорит об А-участке как месте связывания RF. Такие ингибиторы А-участка рибосомы, как тетрациклин и стрептомицин, ингибируют кодонзависимое связывание факторов терминации с рибосомой. EF-G, стабильно связанный с рибосомой ( например, в присутствии фусидовой кислоты), мешает как связыванию комплекса Aa - tRNA EF-TU GTP, так и RF с рибосомой. Белок прокариотической рибосомы L7 / L12, образующий боковой стержень на 50S субчастице, способствует как связыванию факторов элонгации, так и RF. Данные по ингибированию кодонзависимого связывания RF антителами к индивидуальным рибосомным белкам подтверждают, что место связывания RF сильно перекрывается одновременно с А-участком и участком связывания факторов элонгации. [44]
Уже говорилось, что факторы терминации узнают терминирующий кодон, установленный именно в А-участке рибосомы. Прежде всего, кодонзависимое связывание RF возможно только после транслокации пептидил-т РНК из А-участка в Р - участок. В экспериментах in vitro можно прямо связать триплет AUG и инициатор-ную F-Met - tRNA с Р - участком вакантной рибосомы, а затем добавить RF и триплет UAA ( или UAG, или UGA); последние связываются и индуцируют гидролиз F-Met - tRNA в Р - участке с освобождением свободного формилметионина. Довольно очевидно, что в указанном случае терминирующий триплет и RF попадают в вакантный А-участок. Тот факт, что супрессорная аминоацил-т РНК с EF-TU и ГТФ, несущая антикодон, комплементарный терминирующему кодону, конкурирует с RF в процессе трансляции, тоже говорит об А-участке как месте связывания RF. Такие ингибиторы А-участка рибосомы, как тетрациклин и стрептомицин, ингибируют кодонзависимое связывание факторов терминации с рибосомой. EF-G, стабильно связанный с рибосомой ( например, в присутствии фусидовой кислоты), мешает как связыванию комплекса Aa - tRNA EF-TU GTP, так и RF с рибосомой. Белок прокариотической рибосомы L7 / L12, образующий боковой стержень на 50S субчастице, способствует как связыванию факторов элонгации, так и RF. Данные по ингибированию кодонзависимого связывания RF антителами к индивидуальным рибосомным белкам подтверждают, что место связывания RF сильно перекрывается одновременно с А-участком и участком связывания факторов элонгации. [45]
Страницы: 1 2 3