Флуорескамин
Cтраница 2
При этом различные органические вещества после одинаковой химической обработки приобретают почти одинаковую флуоресценцию, что вполне удобно при количественном хроматографичес-ком анализе мсгодом внутренней нормализации, основанном на линейной и одинаковой для всех разделяемых флуоресцирующих компонентов зависимости интенсивности свечения от их концентрации. Например, флуорескамин и фталешй ангидрид - не флуоресцирующие реагенты, которые взаимодействуют с первичными аминогруппами в щелочной среде с образованием флуоресцирующих производных аминов, аминокислот. Производные фталевого альдегида отличаются большей интенсивностью, чем производные флуорескамина, кроме того, фталсвый альдегид растворим в воде, что привлекательно для проведения модификации в водных средах. В табл. 4.15 - 4.16 приведены типовые сорбаты, анализируемые с использованием флуориметрического детектора. [16]
Флуорескамин и о-фталевый альдегид могут быть использованы для количественного определения белков и пептидов. При работе с флуорескамином белки открываются в количестве 0 05 - 0 5 мкг. [17]
Сам флуорескамин и продукты его гидролиза не флуоресцируют, поэтому они не мешают количественному определению продуктов реакции. Данные табл. 11.54 иллюстрируют применимость флуорескамина для определения различных первичных ароматических и алифатических аминов. [18]
После фильтрования с отсасыванием гель насыщают несколькими каплями 10 % - ного триэтиламина в хлороформе. Триэтиламин должен присутствовать в геле перед добавлением флуорескамина для предотвращения превращения производного геля, содержащего флуорофор, в нефлуоресцирующий у лак - тон. Подготовленный раствор оставляют на 10 мин при комнатной температуре, затем гель фильтруют с отсасыванием и промывают хлороформом, метанолом и снова хлороформом. [19]
Этот реагент реагирует с первичными аминогруппами аминокислот и пептидов. Хроматограмму опрыскивают 0 05 % - ным раствором флуорескамина в ацетоне и наблюдают флуоресцирующие пятна. Предварительное и последующее опрыскивание хрома-тограммы 10 % - ным раствором триэтиламина в метиленхлориде повышает чувствительность методики ( 1 нмоль), а также устойчивость образующихся флуоресцирующих пятен. Пятна пролина и гидроксипролина медленно проявляются при нагревании в течение 3 ч при 110 С или через два дня при комнатной температуре. В другом варианте методики бумагу или пластинку, обработанную флуорескамином, вымачивают последовательно в 0 1 М растворе уксусной кислоты в ацетоне и 0 1 М растворе N-хлоросукцинимида в ацетоне. Выдерживают 5 мин, промывают ацетоном и нагревают 5 - 10 мин при 110 С. [20]
Хроматограмму опрыскивают 0 5 % - ным раствором флуорескамина в ацетоне. Для выявления флуоресцирующих пятен пластинку наблюдают в УФ-свете. [21]
Карбоновые кислоты [30] ( рис. VI.24) или их производные ( рис. VI. ЛСД [112], М - нитрозосоединения [113] и производные флуорескамина [114], были разделены на обращенных фазах или определены в лекарственных препаратах и в биологических растворах. [22]
 |
Твердофазный синтезатор пептидов 000 Beckman. США. [23] |
Нагрузка полимера растущими пептидными цепями, как правило, невелика и составляет 0 1 - 0 3 ммоля пептида на 1 г полимера. Полнота реакции ацилирования оценивается на основании реакции с нингидрином или флуорескамином ( см. с. [24]
Высушивают 5 мин на воздухе. Затем ее опрыскивают из пульверизатора 0 001 - 0 005 % - ным раствором флуорескамина в безводном ацетоне. Основной раствор флуорескамина ( 2 мг / мл безводного ацетона) может храниться при 4 С в течение нескольких месяцев. Рабочий раствор флуорескамина готовят из основного раствора: к 80 мл сухого ацетона добавляют 0 4 мл основного раствора. Продукт реакции имеет 2 максимума поглощения при 300 и 390 нм, максимум флуоресценцией при 480 нм. [25]
Анализируемые вещества разделяются по колонке с ионообменной смолой, затем проходят через реакционную спираль ( реактор), а флуоресценция регистрируется с помощью флуориметра. Схема модифицированного анализатора аминокислот приведена на рис. 32.11. Для работы на одной колонке необходимо три микронасоса: первый - для подачи буферного раствора на колонку; второй - чтобы довести величину рН элюата до значения 9 и третий предназначен для смешивания элюата с реагентом, представляющим собой раствор флуорескамина в ацетоне. Скорость реакции достаточно высока, что позволяет использовать короткую реакционную спираль. Далее смесь проходит через проточную кювету флуориметра, и интенсивность флуоресценции регистрируется самописцем. Одновременно много внимания было уделено выделению продуктов реакции аминов с флуорескамином, обладающих низкой полярностью, для анализа которых могла оказаться пригодной высокоскоростная хроматография. [26]
Под действием галогенирующих реагентов вторичные аминокислоты подвергаются окислительному декарбоксилированию с образованием иминов, которые гидролизуются в первичные амины. В качестве галогенирую-щего агента для пролина служил N-хлорсукцинимид: аликвотную часть 1 0 мл 4 - 10 - 6 - 4 - 10 - 5 М раствора пролина или соответственно гидроксипролина смешивали при рН 2 с 1 мл 4 - 1СММ водного раствора хлорсукцинимида, 1 мл 2 % - ного раствора бикарбоната натрия и 1 мл 2 - 10 - 3 М раствора флуорескамина в ацетоне. Интенсивность флуоресценции измеряли через 2 мин после введения флуорескамина. Для производных саркозина оптимальная флуоресценция получается при использовании бромной воды ( 2 - Ю-3 М) вместо хлорсукцинимида. [27]
Высушивают 5 мин на воздухе. Затем ее опрыскивают из пульверизатора 0 001 - 0 005 % - ным раствором флуорескамина в безводном ацетоне. Основной раствор флуорескамина ( 2 мг / мл безводного ацетона) может храниться при 4 С в течение нескольких месяцев. Рабочий раствор флуорескамина готовят из основного раствора: к 80 мл сухого ацетона добавляют 0 4 мл основного раствора. Продукт реакции имеет 2 максимума поглощения при 300 и 390 нм, максимум флуоресценцией при 480 нм. [28]
Воронку, содержащую гель, облучают ближним ультрафиолетовым светом ( 366 нм) и сравнивают флуоресценцию с контрольным образцом. Если замещение близко к полному, интенсивность флуоресценции очень низка и близка к контрольной. Результаты воспроизводятся с раствором флуорескамина, который хранился 1 месяц при 4 С. [29]
Пробу растворяют в метаноле или в воде. В пробирку емкостью 15 мл вносят аликвотную часть раствора ( 0 1 мл), эквивалентную 10 мкг соединений, 15 мл буферной смеси и перемешивают. Затем прибавляют 0 1 мл раствора флуорескамина ( 100 мкг флуорескамина) снова перемешивают, выдерживают 15 мин и измеряют интенсивность флуоресценции с помощью спектрофотометра. При необходимости раствор разбавляют, чтобы отсчет показаний прибора был в пределах шкалы. [30]
Страницы: 1 2 3