Флуорескамин
Cтраница 3
Под действием галогенирующих реагентов вторичные аминокислоты подвергаются окислительному декарбоксилированию с образованием иминов, которые гидролизуются в первичные амины. В качестве галогенирую-щего агента для пролина служил N-хлорсукцинимид: аликвотную часть 1 0 мл 4 - 10 - 6 - 4 - 10 - 5 М раствора пролина или соответственно гидроксипролина смешивали при рН 2 с 1 мл 4 - 1СММ водного раствора хлорсукцинимида, 1 мл 2 % - ного раствора бикарбоната натрия и 1 мл 2 - 10 - 3 М раствора флуорескамина в ацетоне. Интенсивность флуоресценции измеряли через 2 мин после введения флуорескамина. Для производных саркозина оптимальная флуоресценция получается при использовании бромной воды ( 2 - Ю-3 М) вместо хлорсукцинимида. [31]
 |
Соединения, обнаруживаемые флуориметром. [32] |
При этом различные органические вещества после одинаковой химической обработки приобретают почти одинаковую флуоресценцию, что вполне удобно при количественном хроматографичес-ком анализе мсгодом внутренней нормализации, основанном на линейной и одинаковой для всех разделяемых флуоресцирующих компонентов зависимости интенсивности свечения от их концентрации. Например, флуорескамин и фталешй ангидрид - не флуоресцирующие реагенты, которые взаимодействуют с первичными аминогруппами в щелочной среде с образованием флуоресцирующих производных аминов, аминокислот. Производные фталевого альдегида отличаются большей интенсивностью, чем производные флуорескамина, кроме того, фталсвый альдегид растворим в воде, что привлекательно для проведения модификации в водных средах. В табл. 4.15 - 4.16 приведены типовые сорбаты, анализируемые с использованием флуориметрического детектора. [33]
Пробу растворяют в метаноле или в воде. В пробирку емкостью 15 мл вносят аликвотную часть раствора ( 0 1 мл), эквивалентную 10 мкг соединений, 15 мл буферной смеси и перемешивают. Затем прибавляют 0 1 мл раствора флуорескамина ( 100 мкг флуорескамина) снова перемешивают, выдерживают 15 мин и измеряют интенсивность флуоресценции с помощью спектрофотометра. При необходимости раствор разбавляют, чтобы отсчет показаний прибора был в пределах шкалы. [34]
Благодаря такой последовательности реакций, когда растущая полипептидная цепь находится попеременно то в твердой, то в жидкой фазе, можно на определенных этапах полностью удалить как непрореагировавший аминокомпонент, так и недеблокированный пептид. Ход реакции конденсации и деблокирования можно контролировать аналитически с помощью нингидрида или флуорескамина. Первой полимерной аминозащитной группой был связанный носителем бензгидроксикарбонильиый остаток, который позволяет освобождать пептид с помощью 10 % - ной трифторуксусной кислоты в дихлорметане. [35]
Высушивают 5 мин на воздухе. Затем ее опрыскивают из пульверизатора 0 001 - 0 005 % - ным раствором флуорескамина в безводном ацетоне. Основной раствор флуорескамина ( 2 мг / мл безводного ацетона) может храниться при 4 С в течение нескольких месяцев. Рабочий раствор флуорескамина готовят из основного раствора: к 80 мл сухого ацетона добавляют 0 4 мл основного раствора. Продукт реакции имеет 2 максимума поглощения при 300 и 390 нм, максимум флуоресценцией при 480 нм. [36]
Валаш и Агарвал [148] рекомендуют для обнаружения сульфонамидов насыщенный раствор ацетата меди ( II) в метаноле. По окончании элюи-рования пластинку со слоем силикагеля высушивают, а затем погружают в 0 5 % - ный раствор флуорескамина в ацетоне, вновь высушивают и погружают в 0 5 % - ный раствор триэтаноламина в хлороформе. После этого снимают спектр флуоресценции при длинах волн выше 400 нм, возбуждая флуоресценцию облучением светом с длиной волны 290 нм, и измеряют площади пиков. Этим способом удалось обнаружить в мышечных тканях до 0 2 нг сульфадиазина. [37]
Образование продуктов, обладающих флуоресценцией ( сами реагенты не флуоресцируют), позволило значительно увеличить чувствительность метода. С флуорескамином открывается 10 - 9 - 10 - п молей аминокислот. В отличие от нингидрина реакции не мешает присутствие аммиака. Продукт реакции стабилен в течение нескольких часов. Пептиды и белки, проявленные флуорескамином, могут использоваться для определения аминокислотного состава и аминокислотной последовательности. [38]
Этот реагент реагирует с первичными аминогруппами аминокислот и пептидов. Хроматограмму опрыскивают 0 05 % - ным раствором флуорескамина в ацетоне и наблюдают флуоресцирующие пятна. Предварительное и последующее опрыскивание хрома-тограммы 10 % - ным раствором триэтиламина в метиленхлориде повышает чувствительность методики ( 1 нмоль), а также устойчивость образующихся флуоресцирующих пятен. Пятна пролина и гидроксипролина медленно проявляются при нагревании в течение 3 ч при 110 С или через два дня при комнатной температуре. В другом варианте методики бумагу или пластинку, обработанную флуорескамином, вымачивают последовательно в 0 1 М растворе уксусной кислоты в ацетоне и 0 1 М растворе N-хлоросукцинимида в ацетоне. Выдерживают 5 мин, промывают ацетоном и нагревают 5 - 10 мин при 110 С. [39]
Анализируемые вещества разделяются по колонке с ионообменной смолой, затем проходят через реакционную спираль ( реактор), а флуоресценция регистрируется с помощью флуориметра. Схема модифицированного анализатора аминокислот приведена на рис. 32.11. Для работы на одной колонке необходимо три микронасоса: первый - для подачи буферного раствора на колонку; второй - чтобы довести величину рН элюата до значения 9 и третий предназначен для смешивания элюата с реагентом, представляющим собой раствор флуорескамина в ацетоне. Скорость реакции достаточно высока, что позволяет использовать короткую реакционную спираль. Далее смесь проходит через проточную кювету флуориметра, и интенсивность флуоресценции регистрируется самописцем. Одновременно много внимания было уделено выделению продуктов реакции аминов с флуорескамином, обладающих низкой полярностью, для анализа которых могла оказаться пригодной высокоскоростная хроматография. [40]
На рис. 7 - 31 представлена хроматограмма, полученная при высокочувствительном определении производных полиаминов. Существует мнение, что содержащиеся во многих биологических объектах полиамины служат регулирующим фактором в процессах синтеза белка и размножения клеток. Имеются также сообщения о возрастании концентрации полиаминов в моче пациентов с онкологическими заболеваниями. В рассматриваемом примере полиамины переводились во флуоресцирующие производные путем обработки специальным флуоресцирующим реагентом ( флуорескамином), который присоединялся к аминогруппам молекул полиамнов. Полученные флуоресцирующие соединения разделялись и определялись методом микро - ВЭЖХ. [41]
Анализируемые вещества разделяются по колонке с ионообменной смолой, затем проходят через реакционную спираль ( реактор), а флуоресценция регистрируется с помощью флуориметра. Схема модифицированного анализатора аминокислот приведена на рис. 32.11. Для работы на одной колонке необходимо три микронасоса: первый - для подачи буферного раствора на колонку; второй - чтобы довести величину рН элюата до значения 9 и третий предназначен для смешивания элюата с реагентом, представляющим собой раствор флуорескамина в ацетоне. Скорость реакции достаточно высока, что позволяет использовать короткую реакционную спираль. Далее смесь проходит через проточную кювету флуориметра, и интенсивность флуоресценции регистрируется самописцем. Одновременно много внимания было уделено выделению продуктов реакции аминов с флуорескамином, обладающих низкой полярностью, для анализа которых могла оказаться пригодной высокоскоростная хроматография. Что касается аминокислот, то большинство из них, вопреки ожиданиям, давали с флуорескамином два продукта реакции, соотношение которых определялось природой аминокислоты. [42]
Страницы: 1 2 3