Cтраница 3
С момента разработки этого метода гель-хроматография наиболее часто используется для препаративного фракционирования белков, причем обычно как первый этап разделения. Поскольку разрешающая способность этого метода низка, хроматографиче-ские фракции могут содержать несколько компонентов и необходимо дальнейшее разделение другими способами. Анализ смеси неизвестного состава первоначально проводят на гелевой матрице с широким диапазоном фракционирования, собирают фракцию, содержащую интересующий белок, и разделяют ее на геле с 0олее узким диапазоном фракционирования. Выделенную в результате фракцию разделяют далее методом ионообменной хроматографии или электрофореза. [31]
Метод гель-хроматографии, описание которого будет дано ниже, также может быть использован для препаративного фракционирования, однако в этом случае необходимо наличие больших объемов растворителя. [32]
Обычно к системе растворитель - осадитель предъявляется точно такое же требование, как и при препаративном фракционировании: система должна обладать достаточной избирательностью. В обычном методе осаждения коагулирование и выделение фазы геля в осадок следует проводить за возможно более короткий промежуток времени. Напротив, при измерениях мутности необходимо подбирать такие условия, чтобы высадившиеся молекулы полимера оставались суспендированными в фазе золя. Необходимо, чтобы в процессе осаждения образовывались новые частицы, вместо того чтобы уже имеющиеся в системе частицы увеличивались в результате дальнейшего агрегирования. Такие частицы должны обладать по возможности правильной формой и распределение их по размерам не должно быть слишком широким. Желательно, чтобы средние размеры частиц и их способность рассеивать падающий свет не слишком резко зависели от молекулярного веса полимера и от соотношения растворитель - осадитель. Наконец, равновесие между фазами золя и геля должно устанавливаться быстро. [33]
Типичные интегральные кривые распределения приведены на рис. 6.8. Понятие кривая распределения означает, что представленная этой кривой функция распределения является непрерывной. Однако при препаративном фракционировании измеряемые молекулярные массы имеют определенные, а не непрерывные значения, и функция поэтому должна быть дискретной. [34]
Методика получения и анализа функций ММР полиокса еще, по существу, не отработана. Применение традиционных методов препаративного фракционирования в различных системах растворитель - осадитель либо при понижении температуры [142] наталкивается на ряд серьезных трудностей, связанных со спецификой выделения кристаллизующихся полимеров. Лишь в условиях жидко-фазного разделения выше точки плавления полимера возможно получение правдоподобных результатов. [35]
Опыт, накопленный в области дробной перегонки, в хроматографии жидкостей на твердом носителе и газожидкостной хроматографии, показывает, что при увеличении диаметра колонки выше некоторого максимального предела, как правило, происходит резкое снижение эффективности разделения в связи с образованием каналов и / или возникновением горизонтальных перепадов температуры. Две фракции, полученные на приборе для препаративного фракционирования, были подвергнуты дальнейшему фракционированию на одной аналитической крлонке. [36]
Метод фракционирования коацервата весьма сходен с обычным последовательным осаждением и обладает как преимуществами, так и недостатками последнего. Экстрагирование коацервата, вероятно, наиболее полезно при препаративном фракционировании, хотя и подразумевает применение относительно больших количеств раствора и часто при повышенных температурах. Этот метод довольно трудно автоматизировать как в препаративном, так и в аналитическом вариантах. [37]
Такие смеси бывает необходимо разделить на более однородные по молекулярной массе части - фракции. Метод разделения полимеров на фракции называется фракционированием, или препаративным фракционированием. Кроме того, существует так называемое аналитическое фракционирование, которое дает представление о фракционном составе полимера без его разделения на фракции. [38]
Пикет, Кантов и Джонсон [262] составили программу для вычислительной машины. С помощью этой программы можно обрабатывать данные как аналитического, так и препаративного фракционирования методом ГПХ. Интегральные и дифференциальные кривые распределения сведены в таблицы и представлены в виде кривых и гистограмм, а также рассчитаны средне-числовые, средневязкостные, средневесовые и z - средние молекулярные веса. [39]
Турбидиметрическое титрование является очень быстрым и универсальным аналитическим методом, позволяющим получить качественное представление об основных особенностях молекулярновесового распределения полимера. Кроме того, этот метод может оказаться весьма полезным при подборе систем растворитель - осадитель для обычного препаративного фракционирования. Принцип турбидиметрического титрования заключается в следующем. При титровании раствора гетерогенного полимера оса-дителем достигается момент, когда менее растворимая высокомолекулярная часть полимера начинает высаживаться. Если раствор достаточно разбавлен, частички полимера остаются в виде устойчивой суспензии, обусловливая таким образом мутность раствора. Мутность постепенно увеличивается по мере добавления осадителя, пока в конце концов весь полимер не высадится и мутность не станет постоянной. [40]
Необходимо установить различие между аналитическим и препаративным методами фракционирования. Для аналитических целей предельная разрешающая способность колонки проявляется на весьма малых количествах образцов, а при препаративном фракционировании следует подбирать оптимальные условия, учитывая точность разделения и, как правило, большие количества образцов. Методы работы на колонках в различных областях хроматографии хорошо исследованы и подробно описаны [5, 244, 245], поэтому ограничим рассмотрение лишь теми аспектами метода, которые непосредственно относятся к гель-проникающей хроматографии, и последними достижениями в этой области. [41]
Для проверки правильности полученных данных следует в первую очередь сравнить средневесовой молекулярный вес ( Mw), рассчитанный по определенной методом турбидиметрического титрования кривой распределения по молекулярным весам, с этим же молекулярным весом, рассчитанным по данным измерений другими способами. Кроме того, метод турбидиметрического титрования следует применять в таком виде, чтобы полученная по кривой изменения мутности с ( у) функция распределения по молекулярным весам совпадала с распределением, полученным из данных тщательного препаративного фракционирования. [42]
По принципу разделяющего эффекта аналитические и препаративные методы фракционирования можно разделить на группы, приведенные в табл. 6.1. В монографиях [1, 2] приводятся таблицы примеров применения указанных методов для фракционирования некоторых полимеров. В лабораторной практике используют комбинацию различных методов фракционирования, например, дробное осаждение и экстракцию, комбинацию этих методов с седиментациоиным анализом. Методы препаративного фракционирования могут использоваться в различных вариантах, зависящих от цели исследования и вида полимерного образца. Так, фракционирование из растворов может быть осуществлено методами дробного фракционирования и фракционирования на колонке с градиентом температуры; дробное экстрагирование ( как по изменению температуры, так и по скорости диффузии) может быть осуществлено из порошков, коацерватов, из тонких пленок, образованных при нанесении полимера из растворов на инертные носители. Для олигомерных продуктов практически невозможно применение метода дробного осаждения. Часто удобно вместо дробной экстракции использовать метод непрерывной экстракции - с постепенной заменой осадителя растворителем. [43]
Важное преимущество методов препаративного фракционирования заключается в получении значительных количеств фракций, которые могут быть подробно исследованы и переработаны в опытные изделия. Все же подобные методы фракционирования обладают существенным недостатком - это, как правило, большая трудоемкость и длительность получения фракций. Обычно методы препаративного фракционирования можно использовать лишь для решения основных задач и нельзя применить при исследовании большего количества образцов, в частности, для контроля производственных процессов. Кроме того, эти методы подразумевают применение относительно больших количеств фракционируемого вещества. Это обстоятельство, хотя и не очень существенное для большинства технических полимеров, не позволяет воспользоваться препаративными методами для решения многих проблем физиологии, когда исследованию в ряде случаев можно подвергнуть лишь доли миллиграмма вещества. Часто также оказывается невозможным определить степень гомогенности фракций, полученных препаративными методами. [44]
При любой возможности не следует пользоваться лишь методом турбидиметрического титрования. Не следует также делать окончательных выводов только на основании кривых изменения мутности до тех пор, пока не будут применены другие стандартные методы исследований. На практике полезно использовать сочетание метода турбидиметрического титрования и метода препаративного фракционирования. По результатам препаративного фракционирования при этом можно проверить данные турбидиметрического титрования, а турбидиметрия позволит также оценить степень однородности полученных препаративно фракций. [45]