Cтраница 3
Идентичность клонированного и природного генов химозина была подтверждена рестрикционным картированием, ДНК-гибридизацией и секвенированием ДНК. Более того, было показано, что рекомбинантный химозин обладал такой же молекулярной массой, что и природный очищенный химозин теленка, и одинаковой с ним биологической активностью. [31]
При оценке этого ферментного препарата, получаемого из генетически модифицированных дрожжей Kluyveromyces lactis методом ферментации, Комитет экспертов Ф АО / ВОЗ по пищевым добавкам отметил, что микроб-хозяин плазмиды, экспрессирующей химозин, был первоначально получен из молочных продуктов; он известен как источник коммерческого препарата лактазы. Данный микроб не оказывает на человека ни токсигенного, ни патогенного действия. [32]
Готовый продукт был выделен из бактериальных клеток, и в FDA направлена просьба дать разрешение на коммерческое использование рекомбинантного химозина для промышленного производства сыров. Поскольку применение сычужного фермента, содержащего химозин, в сыроваренной промышленности имеет долгую историю, FDA резонно заключила, что если рекомбинантный химозин идентичен природному ферменту, то дополнительное тестирование проводить не обязательно. [33]
Сухой порошок смешивается с поваренной солью. Следовательно, торговые препараты сычужного фермента не являются чистым химозином. В более или менее чистом виде химозин может быть получен осаждением экстрактов спиртом. В растворах сычужный фермент быстро теряет свою активность. [34]
В ходе острых опытов по изучению токсичности, проведенных на крысах, получавших однократную пероральную дозу препарата энзима, равную 5 г / кг массы тела, не было обнаружено никаких признаков токсического действия. При кормлении крыс на протяжении 21 или 91 дня сыром, приготовленным с рекомбинантным - химозином, в дозе 5 г в день, не было отмечено никаких эффектов, связанных с этим продуктом. В ходе других исследований также было отмечено, что введение препарата рекомбинантного энзима в рацион крыс в дозе 1 г / кг массы тела на протяжении 90 дней не приводило ни к каким побочным эффектам. Исследования по определению генотоксичности in vitro показали, что рекомбинантный химозин В не обладает мутагенными свойствами. [35]
Готовый продукт был выделен из бактериальных клеток, и в FDA направлена просьба дать разрешение на коммерческое использование рекомбинантного химозина для промышленного производства сыров. Поскольку применение сычужного фермента, содержащего химозин, в сыроваренной промышленности имеет долгую историю, FDA резонно заключила, что если рекомбинантный химозин идентичен природному ферменту, то дополнительное тестирование проводить не обязательно. [36]
Трансформированные клетки культивировались в строго контролируемых условиях и с использованием питательных сред, содержащих ингредиенты, обычно употребляемые для получения путем ферментации веществ пищевого качества. Остаточные клетки инак-тивировались путем подкисления, Необходимо отметить, что процесс подкисления также обеспечивал и активацию прохимозина А с переходом его в химозин А. [37]
Таким образом первая стадия процесса - коагуляция казеиноген; молока - предшествует всем остальным процессам. Для осуществлени: коагуляции желудок выделяет соответствующие ферменты. У моло дых животных, питающихся только молоком, в особенности у теля и молодых овец, в желудке присутствует особенно сильно действую щий коагулирующий фермент, названный химозином. Действие этоп фермента называют сычужным действием, видимое проявление кото рого есть коагуляция. У взрослых животных процесс коагуляцш казеиногена в желудке имеет место и при отсутствии химозина. Эте свертывание, или сычужное действие, осуществляется у них другив ферментом - пепсином. Следовательно сычужное действие не специ фично для химозина. Разница в действии ферментов - химозин; и пепсина - количественная, а не качественная. [38]
Новые пищевые продукты обычно подвергаются многочисленным проверкам. Однако, чтобы упростить процедуру тестирования и снизить себестоимость продукта, при лицензировании учитывается сходство нового продукта с известным, который и предполагается заменить на рынке. Например, FDA утвердила к применению фермент химозин, полученный с помощью технологии рекомбинантных ДНК и предназначенный для производства сыров, хотя соответствующие испытания не были проведены в полном объеме. Химозин, один из ключевых ферментов сычуга жвачных животных, является сбраживающим молоко протеолитическим ферментом, который гидролизует к-казеин. В результате такого гидролиза в молоке образуется сгусток, который в свою очередь ферментируется с образованием сыра. [39]
Эти фракции значительно различались по способности расщеплять гемоглобин. Можно считать, что медленно двигающаяся фракция является собственно пепсином. Быстрее двигающаяся фракция, по-видимому, является химозином, о существовании которого давно упоминалось, но который не был выделен в чистом виде. В отличие от пепсина химозин не только устойчив при рН 7 0, но и обладает способностью при этом значении рН створаживать молоко. [40]
Полученный при этом неочищенный фермент в дальнейшем хроматографически очищали, а очищенный химозин доводили до степени коммерческой активности с помощью ингредиентов, обычно используемых в коммерческих ферментных препаратах. [41]
Сычужный казеин является лучшим видом белкового сырья для производства галалита. Золи сычужного казеина отличаются наибольшей вязкостью, а гель - наибольшей пластичностью. Цвет сычужного казеина - белый. Указанные свойства сычужного казеина позволяют получать из него прочный и красивый галалит, способный окрашиваться в самые разнообразные и нежные тона. Он получается коагуляцией казеина сычужным ферментом - химозином. В заводских условиях сычужный фермент получается путем экстракции высушенных и измельченных телячьих желудков, четвертое отделение которых называтся сычугом. [42]
В ходе острых опытов по изучению токсичности, проведенных на крысах, получавших однократную пероральную дозу препарата энзима, равную 5 г / кг массы тела, не было обнаружено никаких признаков токсического действия. При кормлении крыс на протяжении 21 или 91 дня сыром, приготовленным с рекомбинантным - химозином, в дозе 5 г в день, не было отмечено никаких эффектов, связанных с этим продуктом. В ходе других исследований также было отмечено, что введение препарата рекомбинантного энзима в рацион крыс в дозе 1 г / кг массы тела на протяжении 90 дней не приводило ни к каким побочным эффектам. Исследования по определению генотоксичности in vitro показали, что рекомбинантный химозин В не обладает мутагенными свойствами. [43]
Далее, необходимо было показать, что рекомбинантный химозин безопасен для применения. Компания представила данные, подтверждающие, что конечный препарат, экстрагированный из бактериальных телец включения и прошедший все необходимые этапы очистки, не загрязнен целыми бактериальными клетками, клеточным дебрисом и другими примесями, в том числе нуклеиновыми кислотами. К-12 нетоксичен и непатогенен для человека. Результаты тестирования на животных не выявили никаких побочных эффектов препарата, что свидетельствовало об отсутствии в нем токсинов. После изучения всей полученной информации FDA пришла к выводу, что рекомбинантный химозин может быть разрешен для коммерческого использования. [44]
Таким образом первая стадия процесса - коагуляция казеиноген; молока - предшествует всем остальным процессам. Для осуществлени: коагуляции желудок выделяет соответствующие ферменты. У моло дых животных, питающихся только молоком, в особенности у теля и молодых овец, в желудке присутствует особенно сильно действую щий коагулирующий фермент, названный химозином. Действие этоп фермента называют сычужным действием, видимое проявление кото рого есть коагуляция. У взрослых животных процесс коагуляцш казеиногена в желудке имеет место и при отсутствии химозина. Эте свертывание, или сычужное действие, осуществляется у них другив ферментом - пепсином. Следовательно сычужное действие не специ фично для химозина. Разница в действии ферментов - химозин; и пепсина - количественная, а не качественная. [45]