Ингибитор - трипсин
Cтраница 3
Вращательное движение ароматических колец аминокислот Phe-45 и Туг-35 в ингибиторе трипсина панкреатического фермента ( BPTI) существенно заторможено. Повышение температуры приводит к переходу от медленного к быстрому обмену. [31]
В состав протеина соевых семян входит много незаменимых аминокислот. В то же время в соевых семенах присутствует фермент уреаза и ингибитор трипсина. Поэтому с целью повышения пищевой и кормовой ценности белковых продуктов из соевых семян они должны быть подвергнуты обработке, инактиви-рующей ферменты семян. [32]
В табл. 7 приведены термодинамические параметры денатурации химотрипсгша, трипсина и ингибитора трипсина. Изменения энтропии при денатурации этих белков необычно велики ( для большинства реакций денатурации величины AS0 лежат в пределах от 10 до - 30 энтр. [33]
Следует подчеркнуть, что в этом небольшом, казалось бы, химическом процессе - отщепление гексапептида от предшественника - заключено важное биологическое значение, поскольку при этом происходят формирование активного центра и образование трехмерной структуры трипсина, а известно ( см. главы 1 и 4), что и белки биологически активны только в своей нативной трехмерной конформации. В то же время поджелудочная железа защищает себя еще одним механизмом - синтезом специфического белка ингибитора панкреатического трипсина. [34]
На протеолитическую и эластолитическую активность большое влияние оказывает мочевина. Полное и, необратимое ингибирование обеих активностей, вызывает трилон Б, частичное - и-хлормеркурибсн-зоат и соевый ингибитор трипсина. [35]
В заключение необходимо обратить внимание на те трудности, которые возникают при изучении термодинамики и кинетики реакции денатурации из-за необратимости этого процесса для большинства белков. Известны лишь немногие случаи обратимой денатурации - например, для трипсина, химотрипсина, рибонуклеазы и ингибитора трипсина. Не следует думать, что немногочисленность известных случаев обратимой денатурации - это лишь следствие недостаточности наших знаний об условиях обращения процесса для большинства белков. Напротив, необратимость денатурации белков, построенных относительно более сложно и менее жестко, чем перечисленные выше, является закономерным следствием ничтожной вероятности полного восстановления чрезвычайно сложной системы связей, стабилизирующих конформацию полипептидных цепочек в нативной молекуле. Однако при рассмотрении обратимых реакций термодинамические и кинетические характеристики наиболее доступны и полнее выявляются. Возможно поэтому, что особый интерес представит в будущем выявление и исследование промежуточных состояний денатурируемого белка, сколь бы кратковременно ни было их существование. [36]
Приведенный перечень наиболее часто употребляемых продажных лигандов с групповой специфичностью, которые нам казалось необходимым хотя бы вкратце охарактеризовать, далеко не исчерпывает всего их многообразия. Сюда не вошли, например, аминокислоты, различные сахара и аминосахара, производные холевой кислоты, спермин, протамин, гистон, биотин и авидин, ингибиторы трипсина, апротинин, желатин и др. В этот перечень не были включены и тно-ловые сорбенты для ковалентной хроматографии, в которой используется образование временных связей между лигандом и веществом. Такие сорбенты будут рассмотрены отдельно. [37]
Соединения типа ( 39) слишком реакцион-носпособны, в силу чего в обычных условиях зарегистрировать их не удается. Существует, однако, структурное доказательство их образования в процессе реакций, катализируемых сериновыми протеиназами. Природные белковые ингибиторы трипсина образуют весьма стабильные комплексы с ферментом. Очевидно, что в фермент-ингибиторных комплексах этого типа интер-медиат не может трансформироваться ни в прямом, ни в обратном направлениях, по-видимому, вследствие слишком прочного-связывания ингибитора. [38]
Сефарозу сначала постепенно переводили в сухой ацетон, промывая на фильтре последовательно серией водно-ацетоновых смесей с увеличивающимся содержанием ацетона, потом обычным и высушенным над молекулярным ситом ацетоном. Реакция шла в течение 10 мин, после чего гель промывками ацетоном и серией смесей ацетона с 1 мМ водным раствором HG1 постепенно переводили в 1 мМ HG1, где его можно хранить на холоду без инактивации по крайней мере в течение трех месяцев. Для посадки лиганд ( трипсин, ингибитор трипсина, БСА, № - ( 6-аминогек-сил) - АМФ) растворяли в холодном 0 2 М Na-бикарбонатном или Na-фосфатном буфере ( рН 7 5), содержащем 0 5 М NaCl вносили туда равный объем промытого тем же буфером сорбента и инкубировали с осторожным перемешиванием на холоду. После окончания посадки лиганда аффинный сорбент обильно промывали буфером, затем ( для удаления неспецифически сорбировавшихся примесей) 0 2 М раствором Na-ацетата ( рН 3) с 0 5 М NaCl, самим 0 5 М NaCl, водой и снова буфером. Авторы указывают, что при хранении активированного геля в течение ночи на холоду в 0 1 М Na-фосфатном буфере ( рН 7 5) инактивация практически не заметна. В тех же условиях активированная BrCN-сефароза снижает свою активность вдвое за 30 мин. Активированный трезилхлоридом полисахаридный гель можно лиофилизировать или хранить в виде суспензии в ацетоне. [39]
Помимо аллостерического механизма имеются и другие возможности изменения активности белка-фермента. Одним из путей управления ферментативными реакциями является возможность изменения свойств фермента при образовании им комплексов с определенными белками. Например, в сыворотке крови содержится два ингибитора трипсина с разным сродством к ферменту. Они образуют с ним комплексы, обладающие различной протеолитической активностью. [40]
В каждой фракции определяют активность и рассчитывают емкость по активности, задержавшейся на колонке. Кроме того, фронтальная хроматография может также обеспечить информацией о возможном присутствии нескольких компонентов с идентичным сродством, но различными объемами, при которых они элюируются. Иногда могут быть определены одновременно две активности, например трипсина и химотрипсина, при элюировании с колонки с иммобилизованным соевым ингибитором трипсина. Данные, полученные в предварительных экспериментах, имеют ценность для планирования главного эксперимента, который должен привести к максимальной очистке на колонке с заданным объемом используемого сорбента. [41]
 |
Хроматография неочищенного панкреатического экстракта на Z-Gly-D. [42] |
Объем фракции 6 мл; фракции отбирались с интервалами 20 мин. Стрелка указывает: а - начало изменения рН от 8 0 до 3 5 ( 0 1 М раствор муравьиной кислоты, рН которой был доведен до 3 5 при помощи аммиака); для наглядности это же изображено пунктиром; б - введение 20 мг ингибитора трипсина в 5 мл водного раствора формиата аммония. [43]
Трипсин [244, 245, 536] связывает свои субстраты существенно тем же способом, что и химо-трипсин. Однако трипсин специфичен к положительно заряженным; остаткам субстрата; боковая цепь Lys или Arg электростатически связывается с остатком аспарагиновой кислоты на дне связывающего кармана фермента. Кристаллографические исследования комплексов трипсина и белковых ингибиторов трипсина [269, 632] показали, что способ связывания очень сходен с образованием комплекса сериновая протеаза - субстрат. Очевидно, ингибитор точно воспроизводит субстрат. Механизм, ведущий к расщеплению субстрата трипсином и к стабилизации комплекса трипсин - ингибитор [269, 536], рассматривается в разд. [44]
Ингибиторы ферментов обычно принято делить на два больших класса: обратимые и необратимые. Это вещества, вызывающие частичное ( обратимое) или полное торможение реакций, катализируемых ферментами. Недавно открыты антиферменты ( антиэнзимы, или антизимы), представляющие собой белки ( или полипептиды), действующие как ингибиторы ферментов. К подобным веществам относятся, например, ингибитор трипсина, обнаруженный в соевых бобах, и сывороточный антитрипсин. Антизимы, вероятнее всего, образуют труднодиссоциируемые комплексы с соответствующими ферментами, выключая их из химических реакций. Иногда ингибитор является составным компонентом предшественника фермента, например пепсина ( см. главу 12), или входит в состав сложных комплексов ферментов, например в состав протеинкиназы и протеинфосфатазы, катализирующих процессы фосфо-рилирования-дефосфорилирования в живых организмах. Однако до сих пор не выяснено, являются ли подобные антиферменты истинными ингибиторами или регуляторными субъединицами, в частности, какова разница в назначении регуляторной ( R) субъединицы в составе протеинкиназы и ингибиторной ( I) субъединицы в составе протеинфосфатазы. [45]
Страницы: 1 2 3 4