Cтраница 3
Для хроматографии относительно длинных ( до 20 остатков) олигонуклеотидов было предложено пришивать на силикагелевую матрицу полиэтиленимин ( PEI), подобно тому как было описано выше для хроматографии белков. [31]
Следует еще раз подчеркнуть, что при этом можно ограничиться весьма умеренными перепадами давления на колонке, допустить заметный уровень его пульсации и вообще отказаться от использования дорогостоящих современных хроматографов для ЖХВД в пользу более простых систем, подобных той, которая была разработана для хроматографии белков фирмой Pharmacia и подробно описана в конце гл. Еще большие скорости элюции могут потребоваться при использовании гель-фильтрации под высоким давлением для целей технологического экспресс-контроля, например в пищевой промышленности, но в этом случае от требования высокой разрешающей способности метода придется отказаться и нельзя будет обойтись без использования специальной аппаратуры для ЖХВД. [32]
Мы привели довольно длинный список широко известных адсорбентов, которые не используются is интересующих нас хромато-графических методах очистки и фракционирования биополимеров, для того чтобы освободить подход к практически единственному варианту адсорбционной хроматографии, который широко и плодотворно применяется для этой цели. Речь идет о хроматографии белков и НК на оксиапатите. [33]
Карбоксильная смола Амберлит IRC-50, являющаяся сополимером метакриловой кислоты и дивинил бензол а, по-видимому, благодаря наличию в ее структуре в основном алифатической цепи и лишь небольших включений ароматических ядер в сшивающем агенте, проявляет полную обратимость сорбции по отношению к многим основным и некоторым нейтральным и кислым белкам. Этот сорбент используется при хроматографии белков в виде очень сильно измельченного порошка с размерами зерен до 200 - 400 меш. Уменьшение размера зерен приводит к повышению емкости сорбции белков и обострению границ зон компонентов в соответствии с теорией хроматографии. [34]
Одной из особенностей, ограничивающих применение ионообменных целлюлозных материалов, является их низкая емкость по сравнению с емкостью ионообменных смол. Низкая емкость не является недостатком при хроматографии белков и других высокомолекулярных полиэлектролитов, но она существенно затрудняет использование ионообменной целлюлозы в других возможных областях. Попытка увеличить емкость с помощью повторных химических обработок вызывает разрушение волокнистой структуры, увеличивает набухание, а подчас и растворение ионита в электролитах. [35]
Мы уже имели случай убедиться в предыдущей главе, что при большой скорости элюции хроматография белков на таких сорбентах идет главным образом на поверхности гранул. [36]
Для высокомолекулярных ионов или амфолитов, например белков, имеет смысл говорить об эффективной емкости обменника, которая зависит от соотношения размеров молекул амфолита и среднего расстояния между ионогенными группами, а также от степени доступности всего объема пористой матрицы обменника для этих молекул. Заметим, что большое значение полной ( низкомолекулярной) емкости ионообменника может оказаться невыгодным для хроматографии белков или нуклеиновых кислот, поскольку в этом случае возможна многоточечная фиксация макромолекул. В такой ситуации может оказаться целесообразным снижение полной емкости обменника за счет выбора значения рН, отвечающего неполной его ионизации; эффективная емкость для макромолекул при этом может остаться максимальной. [37]
В качестве ионитов эти производные целлюлозы могут быть использованы при содержании в них не более 4 - 5 % карбоксильных групп. При большей степени окисления они сильно набухают и растворяются в разбавленных растворах щелочей. Близкое расположение двух карбоксильных групп в дикарбоксилцеллю-лозе может представить существенный интерес для хроматографии белков. [38]
Содержание сильноосновных четвертичных аммониевых групп - ОСаН4К 1 ( С2Н5) з, по-видимому, небольшое. Применение также аналогично DEAE-целлюлозе, но в некоторых случаях ( например, при хроматографии кислых белков и фосфатидов, аминокислот) на ТЕАЕ-целлюлозе достигается более четкое разделение. [39]
Наиболее часто применяемым способом является препаративное разделение с помощью распределительной хроматографии на колонках из целлюлозы. Можно пользоваться также гидратцеллюлозой, оксицеллюло-зой ( которая функционирует, как катионит) и ацетилцеллюлозой. Для некоторых целей пригодны иониты, получаемые из целлюлозы введением диэтиламиноэтильных, карбоксиметильных и фосфатных групп ( для хроматографии белков в сыворотках или соматотропного гормона; Петерсон и Собер; Эллис и Симпсон, см. стр. [40]
В настоящее время в ионообменной хроматографии белков и ферментов применяются почти исключительно эти производные. Структура матриц этих ионов такова, что в нее легко проникают даже крупные макромолекулы, благодаря чему в ионном обмене участвуют группы, расположенные внутри зерен ионита. В ряде статей и монографий ( некоторые из них указаны в табл. 5.13) описаны методы сорбции на ионитах и методы хроматографии белков. В большинстве случаев для хроматографии белков применяют DEAE-целлюлозу. [41]
В настоящее время в ионообменной хроматографии белков и ферментов применяются почти исключительно эти производные. Структура матриц этих ионов такова, что в нее легко проникают даже крупные макромолекулы, благодаря чему в ионном обмене участвуют группы, расположенные внутри зерен ионита. В ряде статей и монографий ( некоторые из них указаны в табл. 5.13) описаны методы сорбции на ионитах и методы хроматографии белков. В большинстве случаев для хроматографии белков применяют DEAE-целлюлозу. [42]
Бурное развитие ЖХВД, особенно в качестве экспресс-метода технологического контроля в пищевой, фармакологической и многих областях химической промышленности, а также в клинике, привело к появлению большого числа специализированной аппаратуры и еще большего количества торговых наименований силикагелей для хроматографии. Ниже мы приведем их далеко не полный список, который позволит читателю ориентироваться в этом многообразии. Но сначала следует описать общие свойства силпкагельных матриц и вариантов их модификации, поскольку, по-видимому, в ближайшие годы область применения снликагелей расширится за пределы сферы анализа смесей относительно низкомолекулярных соединений на хроматографию белков, нуклеиновых кислот п других биополимеров при умеренных давлениях. [43]
Большинство аминокислот практически не поглощает свет в доступной для регистрации области, так что их приходится окрашивать нингидрином. Этот метод окраски будет подробно рассмотрен в приложении 2, посвященном аминокислотным анализаторам. Пептиды и белки поглощают свет в области 206 - 215 нм за счет лептидной связи и в широкой области спектра с максимумом вблизи 280 нм за счет присутствия в них ароматических аминокислот. Азотистые основания и нуклеиновые кислоты хорошо поглощают вблизи 260 нм. Поэтому не удивительно, что основной метод детектирования в хроматографии белков и нуклеиновых кислот - это регистрация поглощения света в ультрафиолетовой области спектра. [44]