Cтраница 2
Советы и преимущества: Описан и другой способ, использующий ион-парную хроматографию. [16]
К числу наиболее важных в практическом отношении приложений динамического модифицирования относится ион-парная хроматография. Особое значение этого метода определяется осложнениями, которыми зачастую сопровождается хроматография ионогенных соединений. Так, даже самые современные ионообменные колонки по эффективности существенно уступают колонкам, заполненным силикагелем и алкилсиликагелями. С другой стороны, ионогенные соединения в режиме обращенно-фа-зовой хроматографии обычно дают асимметрические пики. К тому же наиболее гидрофильные органические кислоты и основания вообще слабо удерживаются неполярными сорбентами. Ион-парная хроматография во многих случаях совмещает в себе достоинства обращенно-фазовой и ионообменной хроматографии. [17]
Сорбенты с дополнительной маркировкой IP или Ion Pair выпускаются специально для ион-парной хроматографии. Они представляют собой обычным образом модифицированные гидрофобные силикагели, но с особенно тщательной блокировкой немодифицированных силанольных групп. Отдельную главу открывает возможность введения в элюент ионов металлов, способных образовывать хе-латные комплексы с некоторыми компонентами фракционируемой смеси веществ. [18]
Подвижные фазы, используемые в этом режиме, аналогичны применяемым в ион-парной хроматографии, но содержат поверхностно-активный модификатор в концентрациях, достаточных для образования мицелл. Первому типу взаимодействия соответствует резкое уменьшение удерживания, третьему - увеличение. Мицеллярная хроматография открывает перед экспериментатором дополнительные возможности варьирования удерживания и селективности. Так, например, в мицеллярном режиме удается элюировать с Ультрасфера ODS антрацен с помощью подвижной фазы, содержащей всего 3 % пропанола. В условиях обычной обращенно-фазовой хроматографии для этого требуется не менее 30 % органического растворителя. Как указано в работах [120, 271], применение мицеллярной хроматографии особенно выгодно при градиентном элюировании. Это связано с тем, что концентрация свободного поверхностно-активного агента в растворе почти постоянна, а увеличение элюи-рующей силы достигается за счет изменения концентрации мицелл. Объем элюента, требуемый для уравновешивания таких систем, не превышает свободного объема системы от инжектора до входа в колонку. Установлено, что чувствительность такой системы к различиям сорбатов меньше, чем у обычных обращенно-фазовых систем. Следовательно, одним из перспективных направлений использования мицеллярной хроматографии может явиться анализ смесей соединений различной химической природы. [19]
Авторы исследования отдают предпочтение сорбенту j - Bon-dapak - Phenyl при ион-парной хроматографии. По их данным, ал-килфенильный сорбент хорошо разделяет как крупные пептиды ( до М 25 000), так и мелкие. При скорости элюции 0 8 мл / мин ( 400 мл / см2 - ч), комнатной температуре и среднем размере гранул 10 мкм на колонке указанного типа размером 0 39 х 30 си они получали симметричные пики пептидов в то время как на октиловой ( Ultrasphere RP-8; 5 мкм; 0 46 х 25 см) и октадециловой ( Zorbax ODS; 6 мкм; 0 46 X 25 см) колонках в аналогичных условиях элюции пики оказывались несимметричными. [20]
Некоторое время считалось, что анализ ионных или ионогенных соединений следует проводить методом ион-парной хроматографии с обращенными фазами. Однако в настоящее время исследователи останавливают свой выбор либо на традиционном варианте ионообменной хроматографии, либо на хроматографии с применением немодифицированного силикагеля или оксида алюминия. В последнем случае применяют водные растворители и буферы. Хроматография на немодифицированном силикагеле или оксиде алюминия имеет существенные преимущества по сравнению с ОФ-вариантом. Силикагель растворим в воде при рН8, однако этот недостаток может быть преодолен при насыщении растворителя силикагелем в фор-колонке. При использовании ТСХ описанные преимущества реализуются наилучшим образом ( см. разд. [21]
Для разделения органических соединений в виде солей, а также кислот и оснований применяют ион-парную хроматографию. В этом случае применяют адсорбенты с привитыми гидрофобными группами, а в элюент, обычно водно-спиртовой или водно-ацетонитрильный, добавляют ионные соединения, анион или катион которых содержит гидрофобную группу. [22]
Ку велика ( ион-модификатор адсорбирован главным образом на неподвижной фазе), механизм удерживания в ион-парной хроматографии становится аналогичным тому, который имеет место в ионообменной хроматографии. В системах ион-парной хроматографии, используемых на практике, могут играть роль типичные механизмы образования ионных пар, а также и типичные ионообменные механизмы. [23]
![]() |
Упрощенный механизм ион-парной экстракции. Образующаяся в воде ионная пара XY распределяется между двумя фазами. [24] |
Естественно, по аналогии с вышеприведенными рассуждениями можно легко вывести уравнения, описывающие разделение катионов в условиях нормально-фазовой ион-парной хроматографии, когда неподвижной фазой является вода. [25]
Если система содержит слабые ионы сорба-тов или слабые ионы-модификаторы, величина рН становится важным параметром при оптимизации условий ион-парной хроматографии. Из-за этих ограничений рабочего диапазона рН для разделения основных соединений часто приходится прибегать к ион-парным реагентам, поскольку такие соединения полностью ионизированы в данном интервале рН и в условиях обычной обращенно-фазовой жидкостной хроматографии элюируются в виде совершенно несимметричных пиков. [26]
В целях получения пептидов коллагена I из шкуры теленка, удобных для определения его полной аминокислотной последовательности, были использованы четыре последовательных этапа ион-парной хроматографии. На 1 - м этапе материал а-цепи ( отделенный гель-фильтрацией на сорбенте Spherogel TSK 4000 SW) разделяли на две фракции, at и аа. На 2 - м этапе фракционировали бромциано-вые пептиды а ] 5 па 3 - м - разделяли короткие пептиды, полученные в результате гидролиза одного из BrCN-пептидов трипсином. [27]
![]() |
Фракционирование семи пептидных гормонов ( / - 7 ион-парной хроматографией на колонке ц, Bondapak - C18 с добавлением разных гидрофобных контрионов ( текст [ Bennet et al., 1981 ]. [28] |
При разделении относительно крупных бромциановых пептидов а -, Р - и - цепей глобина человека 0 1 % - ный раствор ТФУ, помимо своей роли в осуществлении ион-парной хроматографии, оказался очень полезен как прекрасный растворитель для пептидов, в частности гидрофобных. Кроме того, раствор ТФУ прозрачен вплоть до А, 216 нм и легко удаляется лиофилизацией. Использование сорбента с меньшей, чем в рассмотренных выше примерах, гидрофобпостью обусловлено большими размерами пептидов. Колонку уравновешивали 0 1 % - ным водным раствором ТФУ, впрыскивали в нее 100 мкл смеси пептидов и вели элюцию линейным градиентом концентрации изопропанола ( от нуля со скоростью нарастания 1 6 % в минуту) в течение 1 ч при температуре 28 и скорости подачи элюента 0 7 мл / мин. [29]
В статье [86] описано непосредственное, без предварительной де-риватизации, разделение энантиомеров некоторых лекарственных средств основного характера, включая атропины, и средств для местной анестезии на колонках EnantioPac, а также посредством ион-парной хроматографии. [30]