Cтраница 2
Он является восстановителем, дает озазон и при кипячении с кислотами или под влиянием энзимов ( целлобиаз) разлагается с образованием глюкозы. [16]
У многих микроорганизмов в наборе ферментов содержатся целлюлоза, способная гидролизовать целлюлозу до целлобио-зы, и целлобиаза, расщепляющая целлобиозу до глюкозы. [17]
Под экзоглюкозидазной активностью подразумевается активность всех компонентов целлюлазного комплекса, продуцирующих глюкозу при гидролизе КМД, за исключением целлобиазы. За единицу экзоглюкозидазной активности ферментного препарата принимается начальная скорость образования глюкозы из КМЦ ( 10 г / л), выраженная в мкмоль / мин в рН оптимуме действия комплекса при 40 С. Для характеристики препарата или культураль-ной жидкости используют удельную активность, расчитанную на 1 мг ферментного препарата или 1 мл культуральной жидкости. [18]
Данные, изложенные в этих работах, свидетельствуют по существу о том, что в составе целюлазного комплекса, кроме целлобиазы, присутствует фермент, продуктом действия которого является глюкоза. Однако в последнее время, с развитием методов выделения и очистки ферментов, когда были получены гомогенные эндоглюканаза и целлобиогидролаза, продуктами действия которых может быть глюкоза, надежность выводов о присутствии экзоглюкозидаз в большинстве целлюлазных комплексов в значительной мере поколебалась. [19]
Здесь не учитывалась реакция образования глюкозы из целлобиозы под действием целлобиазы, поскольку, во-первых, в использованном ферментном препарате содержание целлобиазы невелико и, во-вторых, вследствие плохой адсорбционной способности целлобиаза практически не связывается с поверхностью целлюлозы. [20]
В литературе широко обсуждаются причины снергизма, к которым относят, например, образование ферментных ассоциатов на поверхности целлюлозы [10, 62, 100], снятие ингибирующего действия на ферменты целлобиозы в присутствии целлобиазы [10, 111] и другие. [21]
Здесь не учитывалась реакция образования глюкозы из целлобиозы под действием целлобиазы, поскольку, во-первых, в использованном ферментном препарате содержание целлобиазы невелико и, во-вторых, вследствие плохой адсорбционной способности целлобиаза практически не связывается с поверхностью целлюлозы. [22]
Отметим наконец, что одним из вариантов многократного ис-ользования ферментов ( в случае гидролиза целлюлозы - целло-иазы) является их применение в иммобилизованном состоянии, [ ля конверсии целлобиозы можно использовать как целлобиазу, ммобилизованную на носителе помещенном в отдельную колои-у, так и вводимую непосредствено в реактор, где осуществляется идролиз ЦСМ. [23]
В табл. 5.2 - 5.4 приведены примеры получения гомогенных по данным аналитического изоэлектрофокусирования и ( или) электрофореза в полиакриламидном геле эндоглюканаз ( см. табл. 5.2), целлобиогидролаз ( см. табл. 5.3) и целлобиаз ( см. табл. 5.4) из различных микробных источников. Как видно из представленных данных, во всех случаях для получения высокоочищенного фермента требуется 4 - 6 стадий. Помимо упомянутой выше близости множественных форм эндоглюканаз и других компонентов комплекса по биохимическим характеристикам, сложность и трудоемкость процесса получения очищенных целлюлаз связана с большим количеством примесей белкового ( ксиланазы, ламинари-назы, пектиназы, протеиназы, другие белки и ферменты) и небелкового характера. Все это приводит к тому, что для ферментов из каждого, а нередко и из одного продуцента разрабатываются оригинальные схемы очистки. [24]
В основу кинетического описания было положено уравнение ( 111) для действия эндофермента, а также уравнения типа ( 112) для действия экзоферментов и простое уравнение Михаэлиса - Ментен для гидролиза целлобиозы под действием целлобиазы. Для получения уравнения скорости деструкции полимерного субстрата авторы работы [13] просто просуммировали три соответствующих уравнения ( для действия эндо - и двух экзоферментов), рассматривая реакции трех данных ферментов как совершенно независимые. На самом деле это не так, поскольку два экзофермента конкурируют за один и тот же субстрат ( невосстанавливающие концевые группы целлоолигосахаридов), а эндофермент фактически поставляет субстрат для экзоферментов и, таким образом, может определять скорость их действия. Аналогично было получено уравнение для скорости накопления глюкозы суммированием соответствующих слагаемых из уравнений, описывающих действие всех четырех ферментов. Полученные таким путем уравнения не применялись для обработки экспериментальных данных, и значимость сделанных при их выводе допущений остается неясной. [25]
Методы ферментного анализа глюкозы широко применяются для определения активности целлюлолитических ферментов, изучения кинетики и механизма действия целлюлаз. В условиях избытка целлобиазы в реакционной смеси они позволяют определять активность целлюлазного комплекса в целом. [26]
Образование глюкозы и целлобиозы непосредственно из целлюлозы происходит под действием различных компонентов целлюлазного комплекса - соответственно, глюкозообразующих ( экзоглюкозидаза и ( или) эндоглюканаза) и целлобиозообразу-ющих ( целлобиогидролаза и ( или) эндоглюканаза) ферментов. Целлобиоза под действием целлобиазы целлюлазного комплекса гидролизуется до глюкозы. [27]
Целлобиазы играют существенную роль в ферментативном гидролизе целлюлозы, поскольку, гидролизуя образующиеся целлобиозу и более высокомолекулярные целлоолиго-сахариды до глюкозы, регулируют активность эндоглюканаз и целлобиогидролаз целлюлазных комплексов. Это позволяет определять активность целлобиазы при концентрации целлобиозы, равной KM, значительно снижая вероятность проявления ферментом трангликозилазной активности. Обычно определение активности фермента проводят по одной точке, фиксируя количество прогидролизовавшейся целлобиозы за выбранный промежуток времени. [28]
Определение экзоглюкозидазной активности осуществляют подобно определению КМЦ-азной активности, регистрируя кинетику накопления глюкозы в реакционной смеси с использованием глюкозооксидазно-пероксидазного метода. Если целлюлазный комплекс содержит целлобиазу, следует подобрать активность глюконолактона, при которой активность целлобиазы равна нулю. [29]
Гель-фильтрация является наиболее мягким способом фракционирования целлюлаз. Метод наиболее эффективен для отделения целлобиаз, имеющих значительно более высокую молекулярную массу, чем эндоглюканазы и целлобиогидролазы, или низкомолекулярных эндоглюканаз с молекулярной массой менее 20000 Да. Недостатком метода является многократное увеличение объема наносимых образцов в ходе элюции, что требует последующего концентрирования, длительность процесса. [30]