Cтраница 3
Доказательства существования мостиковых комплексов фермент - М2 - субстрат, предполагаемых как в механизме железного колеса, так и в других предложенных механизмах [310-313], были получены изучением влияния комплекса Мп2 - аконитаза на СРП в присутствии и в отсутствие субстратов, а также изучением его влияния на скорости релаксации метиленовых протонов цитрата. [31]
Аконитаза ( аконитогидратаза) катализирует превращение цитрата в изоцитрат через стадию мс-аконитовой кислоты. Аконитаза по механизму действия одновременно гидратаза и изомераза. [32]
Она превращается во фторацетил - КоА, который соединяется со щавелево-уксусной кислотой и образует фторлимонную кислоту. Фторлимонная кислота подавляет аконитазу, что приводит к накоплению лимонной кислоты. [33]
Помимо этих двух новых реакций для осуществления цикла необходимо еще и одновременное участие трех ферментов цикла лимонной кислоты ( см. гл. XIV): цитрат-конденсирующего фермента, аконитазы и малат-дегидрогеназы. Необходимо также наличие цепи переносчиков электронов для окисления восстановленного НАД молекулярным кислородом - этот процесс вместе с реакцией, катализируемой малат-синтазой, служит движущей силой цикла. В результате одного оборота цикла окисляются две молекулы ацетил - КоА и образуется одна молекула сукцината. Одновременно происходит удаление двух восстановительных эквивалентов. Образовавшийся таким путем сукцинат может быть затем превращен в углевод в цепи реакций, показанных в правой части фиг. Эта цепь включает две дополнительные реакции, катализируемые ферментами цикла лимонной кислоты - сущинатдегидрогеназой и фумаразой; кроме того, в ней также принимает участие малатдегидрогеназа. [34]
Например, упомянутая выше монофторуксусная кислота включается в цикл трикарбоновых кислот ( цикл Кребса) и превращается во фтор-лимонную кислоту. Последующая реакция дегидратации до фторако-нитовой кислоты под действием аконитазы ингибируется фтором, в связи с чем фторлимонная кислота накапливается в организме и проявляет токсическое действие. [35]
Она легко обнаруживается в корешках проростков кукурузы ( табл. 38); в более старых частях корней и в колеоптилях кукурузы, а также в молодых проростках пшеницы и ржи она, по-видимому, присутствует в наибольшем количестве по сравнению со всеми остальными кислотами. Распространенный в природе изомер этой кислоты имеет цис-кон-фигурацию, и аконитаза, по-видимому, специфична именно в отношении этой формы. Потребление z wc - аконитата in vitro тормозится транс-изомером, причем это торможение в значительной степени носит конкурентный характер. В экстрактах из растений эта кислота часто имеет ттгракс-конфигурацию, однако, поскольку известно, что в кислой среде цис-изомер быстро превращается в транс-форму, многие считают, что последняя, безусловно, является артефактом, возникающим в процессе экстракции. Тем не менее имеются достоверные данные, говорящие о том, что тракс-аконитаг встречается в природных условиях, а Мак-Лен - нан и Биверс [32] недавно показали, что около 95 % аконитата, накапливающегося в корнях кукурузы при подкормке ацетатом, имеет транс-конфигурацию. Извлеченная из корней аконитаза оказалась неактивной в отношении этой кислоты. Однако при введении в корни кукурузы С14 - ягракс-аконитата происходит включение метки в соединения цикла трикарбоновых кислот; это заставляет предполагать, что в корнях имеется какой-то механизм, осуществляющий превращение тракс-изомера в г ые-форму, которая способна использоваться в цикле трикарбоновых кислот. Однако вопрос о том, насколько-общей является эта способность, остается пока открытым. [36]
Отстой ( 1948) изучил этот вопрос и предположил, что лимонная кислота теряет свою симметрию при связывании с асимметричной поверхностью фермента тремя точками. Если превращение лимонной кислоты в несимметричную цис-аконитовую кислоту включает связывание с асимметричной поверхностью фермента аконитазы тремя группами одновременно, то только одна сторона из четырех в асимметричном теперь тетраэдре центрального углеродного атома может быть доступна действию фермента и лишь одна СН2СООН - группа становится в особое положение по сравнению с - остальными. Эта гипотеза была вскоре подтверждена. [37]
В цикле лимонной кислоты для расщепления аце-тил - СоА используются восемь ферментов: цитрат-синтаза, аконитаза, изоци-тратдегидрогеназа, а-кетоглутаратдегид-рогеназа, сукцинил - СоА - синтетаза, сукци-натдегидрогеназа, фумараза и малатде-гидрогеназа. [38]
В ограниченном, как это в настоящее время представляется, числе растительных тканей; присутствуют два фермента - изоцитритаза ( изоцитрат-лиаза) и малатсинтетаза; в тех клетках, где они встречаются, они расположены таким образом, что это делает возможным сопряжение их действия с некоторыми ферментами цикла трикарбоновых кислот; так возникает последовательность реакций, известная под названием глиоксилатного цикла ( фиг. В этом цикле ацетил - КоА конденсируется с оксалоацетатом с образованием цитрата и затем, под действием аконитазы, изоцитрата. [39]
ТМТД и фербам тормозят синтез лимонной кислоты из уксусной, причем степень торможения соответствует величине подавления жизнедеятельности спор. Цирам и абам не влияли на синтез лимонной кислоты, а вызывали ее накопление, что, по-видимому, связано с инактивацией аконитазы. [40]
К ним, в частности, относятся такие ферменты, как мутаротаза, катализирующая реакцию мутарота-ции - превращения а-глюкозы в р-глюкозу; аконитаза, катализирующая изомеризацию лимонной кислоты в изолимонную кислоту, и ряд других. [41]
Известно, что фторуксусная кислота в отличие от многих других ядов не оказывает влияния на ферменты in vitro. Лишь в организме ( in vivo) под действием ферментов она превращается в монофторлимонную кислоту, которая в свою очередь действует как ингибитор аконитазы, фермента, регулирующего один из этапов цикла трикарбоновых кислот. [42]
При участии фермента цитрат ( изоцитрат) - гидро-лиазы ( аконитат-гидратаза; аконитаза, 4.2.1.3) лимонная кислота превращается в изоли-монную кислоту через стадию образования цмс-аконитовой кислоты. Кофактором фермента служат ионы Fe2, которые, по-видимому, функционируют в фермент-металл-субстратном комплексе. Аконитаза является одновременно гидратазой и изомеразой. [43]
Цикл лимонной кислоты протекает в митохондриях. Он начинается реакцией, в которой цитрат-синтаза катализирует конденсацию ацетил - СоА и оксалоацетата, в результате чего образуется цитрат. В присутствии аконитазы цитрат в обратимой реакции превращается в изоци-трат, который затем дегидрируется с образованием ос-кетоглутарата и СО2 с помощью NAD - и NADP-зависимых изоцитратдегидрогеназ. Сукцинил - СоА взаимодействует при участии сукцинил - СоА - син-тетазы с GDP и фосфатом, в результате чего образуется свободный сукцинат, а также GTP, который затем передает свою концевую фосфатную группу на ADP. Сукцинат окисляется до фумарата под действием одного из флавинсодер-жащих ферментов - сукцинатдегидроге-назы. Фумарат обратимо гидратируется фумаразой с образованием L-малата, который затем окисляется NAD-зависимой L-малатдегидрогеназой. В результате окисления малата регенерирует одна молекула оксалоацетата. Эта молекула может теперь соединиться с новой молекулой ацетил - СоА и тем самым начать новый оборот цикла. Опыты с изотопной меткой, в которых изотопами углерода были помечены молекулы топлива или промежуточные продукты, убедительно доказали, что цикл лимонной кислоты представляет собой главный путь окисления углеводов в животных клетках. Общая скорость функционирования цикла в печени определяется скоростью превращения пирувата в ацетил - СоА, а также скоростью реакции, в ходе которой из ацетил - СоА образуется цитрат. Эта реакция катализируется цитрат-синтазой, ал-лостерическим ферментом, на который оказывают ингибирующее действие сук-цинил - СоА и некоторые другие вещества, играющие роль отрицательных модуляторов. [44]
Собственно ЦТК ( рис. 92) начинается с конденсации ацетил - КоА с молекулой щавелевоуксусной кислоты, катализируемой цитратсинтазой. Продуктами реакции являются лимонная кислота и свободный кофермент А. Лимонная кислота с помощью фермента аконитазы последовательно превращается в цис-ако-нитовую и изолимонную кислоты. Последняя превращается в ожетоглутаровую кислоту в реакции, катализируемой изоцит-ратдегидрогеназой. На втором этапе щаве-левоянтарная кислота, все еще, вероятно, связанная с ферментом, подвергается декарбоксилированию. [45]