Cтраница 1
Сахарозные градиенты можно фракционировать вручную или автоматически. Первый способ намного дешевле, однако все же автоматическое фракционирование в сочетании с непрерывной записью поглощения в УФ-свете имеет ряд преимуществ. Прежде всего, при автоматическом фракционировании исключается довольно нудная операция по сбору отдельных фракций и, кроме того, улучшается разделение компонентов ( в особых случаях) и сокращается время фракционирования. Тем не менее во многих случаях фракционирование вручную также дает вполне удовлетворительные результаты. [1]
Если сахарозный градиент фракционируют вручную, то центрифужную пробирку закрепляют в специальном устройстве. [2]
Для приготовления сахарозных градиентов в качестве растворителей можно использовать почти любые буферные ррстворы, однако при этом следует иметь в виду следующие соображения. [3]
При использовании сахарозного градиента для аналитической цели количество наносимой РНК очень мало ( менее 500 мкг), и поэтому при наслаивании образца на поверхность приготовленного в центрифужной пробирке градиента обычно не возникает никаких трудностей. Конец пипетки, содержащей образец, прислоняют к внутренней поверхности боковой стенки центрифужной пробирки и осторожно опускают его по стенке до тех пор, пока он не коснется поверхности градиента. Если пользоваться полуавтоматической пипеткой, то образец можно аккуратно наслоить на поверхность сахарозного градиента без заметного перемешивания. Весьма желательно ( хотя и не обязательно) растворять образец РНК в том же буфере, что и сахарозу. Однако важным условием, которое следует выполнять, является то, что плотность раствора образца должна быть меньше плотности раствора сахарозы в поверхностном слое градиента. Кроме того, между компонентами градиента и раствора образца не должно происходить никаких химических реакций, которые могли бы изменить градиент или РНК. [4]
При использовании сахарозного градиента для препаративных целей образец, по-видимому, следует наносить по методу Бриттена и Робертса [2] так, чтобы градиент концентрации образца был обратным стабилизирующему сахарозному градиенту. [5]
В принципе экспериментатор может приготовить сахарозные градиенты почти с любым характером изменения концентрации. [6]
Существуют два метода автоматического фракционирования сахарозных градиентов. Согласно первому методу, сбор фракций со дна пробирки осуществляют так, как это было описано для фракционирования вручную. При фракционировании другим методом фракции отбирают сверху пробирки. Для этого на дно пробирки накачивают раствор сахарозы с большей плотностью, так что при этом весь градиент вытесняется наверх и попадает в прибор, регистрирующий поглощение протекающего раствора в УФ-свете. [7]
Напомним, что при центрифугировании в сахарозном градиенте разделение основано на различиях в скорости седиментации молекул, а не па различиях в плавучей плотности. Это означает, что молекулы РНК, ДНК и белка при центрифугировании в сахарозном градиенте никогда не достигнут положения равновесия. Их плотность значительно выше плотности самых концентрированных растворов сахарозы, и при длительном центрифугировании все они оседают на дно центрифужной пробирки. Поэтому центрифугирование в сахарозном градиенте не следует путать с центрифу гированием в градиенте солей цезия, которое широко используется для разделения молекул по их плавучей плотности. [8]
За исключением особых случаев, для уменьшения нуклеазной активности сахарозные градиенты рекомендуется охлаждать перед использованием и центрифугировать их на холоду. В этом отношении приготовление градиентов в холодной комнате не дает особого выигрыша, поскольку их все равно приходится оставлять на некоторое время для того, чтобы в результате диффузии исчезли локальные искажения концентрации и градиент выровнялся в целом. Если градиенты предполагают использовать сразу же вскоре после приготовления, то их можно быстро охладить в ледяной бане. Если же градиенты используют не сразу, то их можно оставить в холодильнике на несколько часов. Отличное разделение РНК может быть, получено при центрифугировании даже в таких сахарозных градиентах, которые были приготовлены за 24 час перед их использованием. [9]
Не полностью очищенные препараты РНК можно анализировать, центрифугируя их в сахарозных градиентах, содержащих додецилсульфат натрия, который вызывает диссоциацию РНК и связанных с ними белков. Поскольку додецилсульфат натрия образует комплексы с основными белками, он подавляет нуклеазную активность. Однако присутствие додецилсульфата не всегда желательно. [10]
РНК, экстрагированная из асцитных опухолей Кребс II и отцентрифугированная затем в сахарозном градиенте, образует три пика, поглощающих при 256 ммк. Если клетки в течение короткого времени ( 20 мин) инкубировать с уридином, меченным тритием, то радиоактивность обнаружится только в двух пиках: меньшая - в пике 4S - PHK ( растворимая РНК) и большая - в очень небольшом пике 40S - PHK. Обычные клетки и клетки, зараженные вирусом ЕМС, дают аналогичные результаты. При более длительной инкубации ( 2 час) радиоактивность находят не только в пике 40S - PHK, но и в трех пиках, поглощающих в ультрафиолете. Такая же картина наблюдается в зараженных клетках. [11]
Какого типа и какой длины молекулы должны выявляться при центрифугировании РФП ДНК в щелочном сахарозном градиенте. В молекуле ДНК фХ174 содержится 5386 пар оснований. [12]
Во многих работах сообщается о добавлении Mg2 к буферным растворам, на которых готовят сахарозные градиенты для фракционирования РНК. По-видимому, этого делать не следует, поскольку Mg2 может вызывать агрегацию РНК [7] и поэтому, напротив, его нужно удалять из буферных растворов, которые используются для приготовления градиентов. С другой стороны, к буферным растворам часто добавляют ЭДТА, чтобы удалить следовые количества того Mg2, который может быть связан с РНК. Хотя добавлять ЭДТА к растворам весьма желательно, однако не нужно добавлять его в слишком большом количестве. ЭДТА сильно поглощает в УФ-свете, особенно при длинах волн менее 260 ммк. Если концентрация ЭДТА в сахарозном градиенте будет больше 0 01 М, то это может помешать анализу РНК. [13]
В действительности лишь благодаря случайному счастливому совпадению было обнаружено, что именно для этого сахарозного градиента увеличение плотности и вязкости почти точно уравновешивается увеличением силы тяжести по мере того, как молекулы перемещаются через градиент в направлении к дну пробирки. Поэтому нет никаких оснований прямую зависимость между s и d, найденную Мартином и Амесом для одного сахарозного градиента, переносить на сахарозные градиенты любого типа, хотя отличия могут оказаться и весьма небольшими. При центрифугировании в градиенте сахарозы от 0 5 до 1 0 М ( примерно 16 - 30 %) в роторе SW 25 Стэелин и др. [5] нашли, что для 28 S - и 18 S - pPHK, выделенных из печени крысы, отношение c s / ie всегда было равно 1 6, независимо от времени центрифугирования. Для получения дополнительных сведений я выбрал из своего рабочего журнала 10 градиентов из тех, которые были изучены нами за последние два года. В первом приближении такое среднее значение величины s является вполне удовлетворительным. [14]
Используя имеющиеся в продаже приборы, можно смонтировать устройство, позволяющее непрерывно регистрировать радиоактивность при фракционировании сахарозного градиента. Готовые приборы такого рода пока еще мне не встречались, однако, по-видимому, они уже имеются. [15]