Cтраница 3
В этих условиях РНК обладает максимальной растворимостью, однако следует иметь в виду, что растворимость не всегда имеет решающее значение. В присутствии 0 01 М Na в сахарозном градиенте молекулы РНК имеют удлиненную форму, и поэтому время центрифугирования, необходимое для их эффективного разделения, сильно увеличивается. При концентрации Na, равной 0 15 М, заряды фосфатных групп в значительной степени уравновешиваются зарядами ионов Na, и молекулы РНК приобретают более компактную конфигурацию. С другой стороны, вносить слишком много соли в сахарозный градиент нежелательно, поскольку известно [4], что при концентрации Na, равной 0 5 М, происходит неспецифическая ассоциация молекул РНК. [31]
Наиболее важно то, что по коэффициентам седиментации можно оценить молекулярный вес биополимеров. Гирер ( 13 ] и Спирин [14] независимо друг от друга предприняли попытку вывести формулу, которая позволяла бы по величине константы седиментации рассчитывать молекулярный вес РНК. На основании констант седиментации, полученных при центрифугировании в сахарозном градиенте, можно приблизительно определять молекулярный вес РНК по любой из этих формул, однако ошибка при таком расчете может оказаться довольно большой. [32]
За исключением особых случаев, для уменьшения нуклеазной активности сахарозные градиенты рекомендуется охлаждать перед использованием и центрифугировать их на холоду. В этом отношении приготовление градиентов в холодной комнате не дает особого выигрыша, поскольку их все равно приходится оставлять на некоторое время для того, чтобы в результате диффузии исчезли локальные искажения концентрации и градиент выровнялся в целом. Если градиенты предполагают использовать сразу же вскоре после приготовления, то их можно быстро охладить в ледяной бане. Если же градиенты используют не сразу, то их можно оставить в холодильнике на несколько часов. Отличное разделение РНК может быть, получено при центрифугировании даже в таких сахарозных градиентах, которые были приготовлены за 24 час перед их использованием. [33]
Во многих работах сообщается о добавлении Mg2 к буферным растворам, на которых готовят сахарозные градиенты для фракционирования РНК. По-видимому, этого делать не следует, поскольку Mg2 может вызывать агрегацию РНК [7] и поэтому, напротив, его нужно удалять из буферных растворов, которые используются для приготовления градиентов. С другой стороны, к буферным растворам часто добавляют ЭДТА, чтобы удалить следовые количества того Mg2, который может быть связан с РНК. Хотя добавлять ЭДТА к растворам весьма желательно, однако не нужно добавлять его в слишком большом количестве. ЭДТА сильно поглощает в УФ-свете, особенно при длинах волн менее 260 ммк. Если концентрация ЭДТА в сахарозном градиенте будет больше 0 01 М, то это может помешать анализу РНК. [34]
Для того чтобы отделить рибосомы от полисом, был использован метод центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Этот метод позволяет разделять материалы, осаждающиеся с разными скоростями в сильном гравитационном поле, и заключается в следующем. Пластмассовую центрифужную пробирку наполняют раствором сахара, концентрация которого плавно меняется, например от 30 % на дне пробирки до 15 % в верхнем слое. Для получения градиента медленно наполняют пробирку из двух сосудов, содержащих 15-процентный и 30-процентный раствор сахарозы. По мере наполнения количество приливаемого 30-процентного раствора убавляют, а 15-процентного - прибавляют. Испытуемый материал, состоящий из молекул различной величины, осторожно наслаивается поверх раствора сахара, после чего пробирку помещают в ротор центрифуги. Сахарозный градиент сохраняется во время центрифугирования и после него за счет силы тяжести. Во время центрифугирования молекулы разного размера проходят неодинаковое расстояние и остаются разделенными и после центрифугирования. [35]
Эти расчеты можно использовать только как самые предварительные, поскольку сразу же после начала центрифугирования на градиент концентрации образца будут влиять по крайней мере два других фактора. Первый из них выявляется в тот м: омент, когда молекулы РНК проходят через резко выраженную зону, отделяющую сахарозу основного градиента от сахарозы градиента образца. При этом полоса образца суживается, и концентрация его градиента возрастает. Второй фактор, влияющий на градиент концентрации образца, обусловлен присутствием в большинстве градиентов разных по величине РНК. По мере отделения быстро седимен-тирующих РНК от медленно седиментирующих молекул РНК градиент концентрации образца будет уменьшаться. Суммарное влияние этих двух факторов предугадать очень трудно. Кроме того, при попытке использовать максимальную емкость того или иного градиента нужно отдавать себе отчет в том, что всякое увеличение высоты слоя наносимого образца не может не привести к ухудшению разделения РНК. Поэтому общий накопленный опыт, а также индивидуальные эксперименты помогут установить в каждом конкретном случае те необходимые предельно допустимые количества РНК, которые можно наносить на сахарозный градиент. [36]
Еще не ясно, какие факторы вызывают седиментацию этих капель. Однако, по-видимому, возможность отрыва и седиментации капель существует всегда, как бы тщательно и аккуратно ни наносили образец на поверхность градиента. Тем не менее на практике при центрифугировании в 25 мл градиента удается вполне удовлетворительно расфракционировать но крайней мере 1 мг РНК. Несомненно, некоторое перемешивание зон образца и градиента при наслаивании образца все же происходит даже тогда, когда оно не заметно для глаза. Браке [9] указывает, что для предотвращения отрыва и седиментации капель образец следует очень осторожно перемешать с верхней порцией градиента. Они установили, что резкой границы между зонами образца и градиента не образуется, если образец наносить таким образом, чтобы градиент его концентрации был обратным по отношению к градиенту концентрации сахарозы. Следующий пример может помочь понять этот метод нанесения образца. Допустим, что на 24 мл градиента ( 15 - 30 %) сахарозы необходимо нанести 1 мг РНК. РНК помещают в резервуар малой системы ( фиг. Плотность этого раствора сахарозы должна быть несколько меньше плотности верхней зоны сахарозного градиента. Затем включают мешалку и образец наслаивают на основной градиент. Поскольку РНК находится в резервуаре системы, то концентрация РНК в нанесенном образце будет увеличиваться в направлении от дна пробирки кверху, а концентрация стабилизирующего сахарозного раствора, как и основного сахарозного градиента, который находится под нанесенным образцом, будет уменьшаться в том же направлении. [37]
Еще не ясно, какие факторы вызывают седиментацию этих капель. Однако, по-видимому, возможность отрыва и седиментации капель существует всегда, как бы тщательно и аккуратно ни наносили образец на поверхность градиента. Тем не менее на практике при центрифугировании в 25 мл градиента удается вполне удовлетворительно расфракционировать но крайней мере 1 мг РНК. Несомненно, некоторое перемешивание зон образца и градиента при наслаивании образца все же происходит даже тогда, когда оно не заметно для глаза. Браке [9] указывает, что для предотвращения отрыва и седиментации капель образец следует очень осторожно перемешать с верхней порцией градиента. Они установили, что резкой границы между зонами образца и градиента не образуется, если образец наносить таким образом, чтобы градиент его концентрации был обратным по отношению к градиенту концентрации сахарозы. Следующий пример может помочь понять этот метод нанесения образца. Допустим, что на 24 мл градиента ( 15 - 30 %) сахарозы необходимо нанести 1 мг РНК. РНК помещают в резервуар малой системы ( фиг. Плотность этого раствора сахарозы должна быть несколько меньше плотности верхней зоны сахарозного градиента. Затем включают мешалку и образец наслаивают на основной градиент. Поскольку РНК находится в резервуаре системы, то концентрация РНК в нанесенном образце будет увеличиваться в направлении от дна пробирки кверху, а концентрация стабилизирующего сахарозного раствора, как и основного сахарозного градиента, который находится под нанесенным образцом, будет уменьшаться в том же направлении. [38]