Cтраница 2
Одним из самых простых и широко распространенных методов фракционирования нуклеиновых кислот и других макромолекул является центрифугирование в сахарозном градиенте. Раствор с градиентом концентрации сахарозы служит одновременно несущей и стабилизурующей средой, через которую движутся макромолекулы под действием центробежной силы. Благодаря наличию непрерывного градиента концентрации сахарозы возможность перемешивания компонентов при встряхивании и других механических воздействиях сводится к минимуму. Этому способствует также и довольно высокая вязкость растворов сахарозы. [16]
Их суспендируют в буфере ТМА ( - 2), диа - лизуют 3 ч против ТМА ( - 4), наслаивают на сахарозный градиент [ 12 - ЗО % в ТМА ( - 4) ] и центрифугируют при 2 - 4 С на роторе SW 25 Д около 2О ч при 25 000 об / мин. [17]
Для разделения РНК чаще всего используют градиенты концентрации сахарозы от 15 до 30 % или от 5 до 20 %; имеются сведения об использовании также и других сахарозных градиентов, например градиентов концентрации от 10 до 40 % сахарозы. По-видимому, оптимальная разница концентраций сахарозы в градиенте может варьировать в зависимости от природы разделяемой РНК и цели опыта. В нашей лаборатории мы обычно используем градиенты от 15 до 30 % сахарозы. В этих градиентах оба вида рибосомных РНК разделяются несколько лучше, чем в градиентах от 5 до 20 % сахарозы. Время центрифугирования, необходимое для максимального разделения 18S - и 28S - PHK ( мы обычно работаем на роторе SW25 при 25 000 об / мин и температуре 0 - 5), составляет 17 - 18 час. Это означает, что центрифугирование можно начать довольно поздно во второй половине дня и закончить утром следующего дня. [18]
При использовании сахарозного градиента для препаративных целей образец, по-видимому, следует наносить по методу Бриттена и Робертса [2] так, чтобы градиент концентрации образца был обратным стабилизирующему сахарозному градиенту. [19]
Выражение градиент плотности сахарозы, часто встречающееся в литературе, является точным, но длинным. Название сахарозный градиент означает градиент концентрации сахарозы, а это в сущности и есть градиент плотности раствора. [20]
В этих условиях РНК обладает максимальной растворимостью, однако следует иметь в виду, что растворимость не всегда имеет решающее значение. В присутствии 0 01 М Na в сахарозном градиенте молекулы РНК имеют удлиненную форму, и поэтому время центрифугирования, необходимое для их эффективного разделения, сильно увеличивается. При концентрации Na, равной 0 15 М, заряды фосфатных групп в значительной степени уравновешиваются зарядами ионов Na, и молекулы РНК приобретают более компактную конфигурацию. С другой стороны, вносить слишком много соли в сахарозный градиент нежелательно, поскольку известно [4], что при концентрации Na, равной 0 5 М, происходит неспецифическая ассоциация молекул РНК. [21]
При таком приготовлении градиента образца следует иметь в виду, что градиент РНК должен быть не выше обратного ему градиента сахарозы, иначе такая система не будет стабильной. Для тех, кто желает использовать максимальную емкость сахарозных градиентов в препаративных целях, мы приводим пример расчета, позволяющего определить емкость градиентов. [22]
Когда эти капли попадут в зону равной им: плотности, в них начнет диффундировать сахароза. Конечно, в спою очередь и РНК будет диффундировать в близлежащие области сахарозного градиента. Однако сахароза диффундирует быстрее, чем РНК, что в конечном счете приведет к дальнейшему увеличению плотности, и поэтому капли могут перемещаться до самого дна пробирки. [23]
Мартин и Амес [12] показали, что скорость движения нескольких белков через градиент сахарозы линейно зависит от времени. Это позволяет определить константу седиментации s неизвестного вещества, центрифугируя его в сахарозном градиенте в присутствии сходного с ним вещества, для которого константа седиментации известна. [24]
Напомним, что при центрифугировании в сахарозном градиенте разделение основано на различиях в скорости седиментации молекул, а не па различиях в плавучей плотности. Это означает, что молекулы РНК, ДНК и белка при центрифугировании в сахарозном градиенте никогда не достигнут положения равновесия. Их плотность значительно выше плотности самых концентрированных растворов сахарозы, и при длительном центрифугировании все они оседают на дно центрифужной пробирки. Поэтому центрифугирование в сахарозном градиенте не следует путать с центрифу гированием в градиенте солей цезия, которое широко используется для разделения молекул по их плавучей плотности. [25]
В действительности лишь благодаря случайному счастливому совпадению было обнаружено, что именно для этого сахарозного градиента увеличение плотности и вязкости почти точно уравновешивается увеличением силы тяжести по мере того, как молекулы перемещаются через градиент в направлении к дну пробирки. Поэтому нет никаких оснований прямую зависимость между s и d, найденную Мартином и Амесом для одного сахарозного градиента, переносить на сахарозные градиенты любого типа, хотя отличия могут оказаться и весьма небольшими. При центрифугировании в градиенте сахарозы от 0 5 до 1 0 М ( примерно 16 - 30 %) в роторе SW 25 Стэелин и др. [5] нашли, что для 28 S - и 18 S - pPHK, выделенных из печени крысы, отношение c s / ie всегда было равно 1 6, независимо от времени центрифугирования. Для получения дополнительных сведений я выбрал из своего рабочего журнала 10 градиентов из тех, которые были изучены нами за последние два года. В первом приближении такое среднее значение величины s является вполне удовлетворительным. [26]
В действительности лишь благодаря случайному счастливому совпадению было обнаружено, что именно для этого сахарозного градиента увеличение плотности и вязкости почти точно уравновешивается увеличением силы тяжести по мере того, как молекулы перемещаются через градиент в направлении к дну пробирки. Поэтому нет никаких оснований прямую зависимость между s и d, найденную Мартином и Амесом для одного сахарозного градиента, переносить на сахарозные градиенты любого типа, хотя отличия могут оказаться и весьма небольшими. При центрифугировании в градиенте сахарозы от 0 5 до 1 0 М ( примерно 16 - 30 %) в роторе SW 25 Стэелин и др. [5] нашли, что для 28 S - и 18 S - pPHK, выделенных из печени крысы, отношение c s / ie всегда было равно 1 6, независимо от времени центрифугирования. Для получения дополнительных сведений я выбрал из своего рабочего журнала 10 градиентов из тех, которые были изучены нами за последние два года. В первом приближении такое среднее значение величины s является вполне удовлетворительным. [27]
При использовании сахарозного градиента для аналитической цели количество наносимой РНК очень мало ( менее 500 мкг), и поэтому при наслаивании образца на поверхность приготовленного в центрифужной пробирке градиента обычно не возникает никаких трудностей. Конец пипетки, содержащей образец, прислоняют к внутренней поверхности боковой стенки центрифужной пробирки и осторожно опускают его по стенке до тех пор, пока он не коснется поверхности градиента. Если пользоваться полуавтоматической пипеткой, то образец можно аккуратно наслоить на поверхность сахарозного градиента без заметного перемешивания. Весьма желательно ( хотя и не обязательно) растворять образец РНК в том же буфере, что и сахарозу. Однако важным условием, которое следует выполнять, является то, что плотность раствора образца должна быть меньше плотности раствора сахарозы в поверхностном слое градиента. Кроме того, между компонентами градиента и раствора образца не должно происходить никаких химических реакций, которые могли бы изменить градиент или РНК. [28]
Напомним, что при центрифугировании в сахарозном градиенте разделение основано на различиях в скорости седиментации молекул, а не па различиях в плавучей плотности. Это означает, что молекулы РНК, ДНК и белка при центрифугировании в сахарозном градиенте никогда не достигнут положения равновесия. Их плотность значительно выше плотности самых концентрированных растворов сахарозы, и при длительном центрифугировании все они оседают на дно центрифужной пробирки. Поэтому центрифугирование в сахарозном градиенте не следует путать с центрифу гированием в градиенте солей цезия, которое широко используется для разделения молекул по их плавучей плотности. [29]
Отводную трубку опускают в центрифужную пробирку и прислоняют к внутренней стенке так, чтобы эта трубка все время находилась чуть выше уровня раствора, наполняющего эту пробирку. Поскольку в ходе формирования градиента концентрация сахарозы в растворе постепенно снижается, то в пробирке менее концентрированный раствор наслаивается на слои более концентрированного раствора; таким образом формируется непрерывный градиент плотности. Если скорость вытекания жидкости из смесителя достаточно мала, то существенного перемешивания раствора сахарозы в центрифужной пробирке не происходит. Насколько мне известно, оптимальная скорость наполнения пробирки сахарозным градиентом еще не установлена, однако принято считать, что продолжительность приготовления одного градиента составляет 10 - 15 мин. Если экспериментатор пожелает проверить свой собственный метод приготовления градиента, то ему потребуется только расфракционировать градиент так, как это будет описано далее, и определить коэффициент преломления каждой фракции. [30]