Cтраница 3
К первой группе относятся 8 аминокислот: 6 с алифатической боковой цепью - аланин, валин, лейцин, изолеиции, метионин, пролин и 2 с ароматической - фенилаланин и триптофан. Аспараги новая и глутами новая кислоты принадлежат к классу аминоднкарбоновых кислот, их р-и у-карбоксильные группы при рН7 0 заряжены отрицательно. К основным аминокислотам, боковые цепи которых могут нести положительный заряд, относятся лизин, аргинин и гистидин. Аминогруппа личина и гуанидиновая группировка аргинина при рН 7 0 протоннрованы. В щелочных условиях отрицательно заряженными могут быть боковые группы тирозина и цистеина. [31]
Все а - аминокислоты и образованные из них пептиды в большинстве случаев реагируют при комнатной температуре с азотистой кислотой количественно в течение 5 мин. Вторая аминогруппа лизина ( е-поло-жение) реагирует в течение 30 мин. Азот, входящий в состав пирро-лидинового, индолового и имидазолового колец, не реагирует, поэтому в результате анализа определяется только половина всего количества азота триптофана, треть количества азота гистидина и четверть количества азота аргинина. Пролин и оксипролин совсем не отщепляют азота, Гуанидиновая группировка HjN - C ( NH) - HN - , содержащаяся в гуа-ниди-не, креатине и аргинине, не реагирует с азотистой кислотой. [32]
Гуанидиногруппа, имеющаяся в боковом радикале аргинина, является сильно основной и остается протонированной на всех стадиях обычного пептидного синтеза. При этом, строго говоря, не требуется добавочная защита, и имеется немало синтезов с производными аргинина, в которых гуанидиногруппа аргинина оставалась незащищенной. Это обстоятельство особенно полезно на завершающих стадиях синтеза, когда протонирование гуанидиногруп-пировки обеспечивает нужную растворимость вещества в полярной среде. Однако в общем случае считается полезным использовать в синтезе защищенную по гуанидиновой группировке форму аргинина. [33]
К 1 - й группе относятся шесть А. В аспарагиновой и глутаминовой кислотах р - и у-карбоксильные группы при рН 7 0 заряжены отрицательно. Аминогруппа лизина и гуанидиновая группировка аргинина несут положит, заряд ( протонированы) в нейтральной среде, а имидазольная группировка гистидина - в кислой. В щелочных условиях отрицат. Характерной особенностью остатков цистеина является их способность в составе молекулы белка подвергаться окислению с образованием остатков цистина. В 1986 в ряде белков архебак-терий, истинных бактерий ( эубактерий) и животных была обнаружена а - А. [34]
К 1 мл образца в пробирке добавляют 1 мл раствора тиомочевины ( 2 г тиомочевины в 10 мл 5 N НС1), тщательно перемешивают и оставляют на 10 мин. При нейтрализации следят за выделением тепла; при сильном выделении тепла пробирку охлаждают льдом. К некоторой части полученного раствора добавляют 2 % - ный водный раствор нитропруссида натрия. Ко второй половине раствора добавляют одну каплю 0 1 % - ного раствора ( 3-нафтола в 95 % - ном этиловом спирте и хорошо перемешивают, после чего прибавляют две капли 5 % - ного водного бромноватистокислого натрия и по образованию апельсиново-красной окраски судят о присутствии гуанидиновой группировки. [35]
Защита карбоксильной группы путем ее перевода в соответствующий сложный эфир, рассмотренная в предыдущем разделе, в известном смысле способствует активации карбоксильной функции. В связи с этим для предотвращения побочных реакций используемые для синтеза гидрази-дов производные гидразина предварительно блокируют подходящей N-защитной группой. Такой прием позволяет легко осуществить переход к соответствующему гидразиду и, кроме того, делает возможным дальнейшее использование азидного метода, например в случае высших пептидов, чрезвычайно лабильных к гидразинолизу. Замещенные гидразиды целесообразно применять также в комбинации с фталильной группой, крайне чувствительной к гидразинолизу, и трифторацетильной группой, отщепляющейся при действии гидразина, что объясняется его сильно основными свойствами. Наличие гуанидиновых группировок в пептидах, содержащих остатки аргинина [890] или нитро-аргинина [292], является причиной побочных реакций во время гидразинолиза; в этом случае применение азидного метода также возможно лишь при использовании защищенных гидразидов. Необходимость введения дополнительной N-защитной группы является недостатком рассматриваемого метода. При выборе этой группы следует иметь в виду возможность селективного удаления любой другой защитной группировки, присутствующей в данном пептиде. [36]
После проведения гидролиза белка полученную смесь аминокислот необходимо разделить и количественно проанализировать. Разумеется, необходимо перевести свободные аминокислоты в более летучие для ГЖХ производные и в этом состоит трудность. Большинство известных методов включает две реакции: образование сложного эфира по карбоксильной группе и ацилиро-вание аминогруппы. Крайне важно, чтобы обе реакции протекали практически нацело, а образовавшиеся производные можно был о бы разделить. Несколько сотен опубликованных за последние 25 лет работ свидетельствуют о трудностях, которые при этом возникают. Карбоксильную группу обычно переводят в сложноэфирную, используя простые радикалы от метила до пентила, в то время как для защиты амино - или иминогруппы популярны W-трифтораце-тильная и А / - гептафтормасляная группы, так как они позволяют проводить ГЖХ-анализ с высокой чувствительностью при использовании детектора электронного захвата. Трудности связаны с аци-лированием гуанидиновой группировки аргинина и термолабильностью производных цистеина из-за реакций р-элиминации. [37]