Cтраница 3
В некоторых случаях отсутствует информация о Кщ и ап анализируемого образца или не имеется узкодисперсных стандартов. Тогда привлекают добавочную информацию об образцах. Mw / Mn 2), то максимум пика хроматограммы соответствует ММ д / MwMn. Когда известно ММР полидисперсного образца, калибровку колонки проводят следующим образом. Строят интегральную хроматограмму и сопоставляют значения ММ и V при одинаковых интегральных долях. [31]
Тайпоксин Karlsson, 1973) является слабо кислым белком ( ИЭТ рН 5), который диссоциирует при рИ 3 на две субъединицы, очищенные гельфильтрацией. Рекомбинация не приводит к восстановлению первоначальной активности. Возможно, что молекулярный вес танпоксина и субъединиц завышен. Не исключено, что они являются гликопротеидами и поэтому элю-ируют раньше, чем глобулярные белки соответствующего молекулярного веса, которые были использованы для калибровки колонки при оценке молекулярного веса. Однако Eaker ( 1974) полагает, что может иметь место гомологичность между фосфолипазой А ( из яда N. Этот вывод автор аргументирует сходством в аминокислотной последовательности перечисленных соединений. [32]
Для калибровки колонок необходимо наличие серии соединений с известной молекулярной массой или достаточно хорошо охарактеризованных узких фракций полимеров, которые, кроме того, должны иметь структурное сходство с исследуемыми веществами, что иногда создает дополнительные трудности при анализе углеводов. В отсутствие подходящих стандартов для калибровки колонок при анализе мо-лекулярно-массового распределения других полисахаридов часто применяют декстраны фирмы Pharmacia. Однако следует подчеркнуть, что при анализе полисахаридов, структурно отличающихся от декстранов, на результаты калибровки можно опираться при условии, что соотношение между молекулярной массой и молекулярным размером исследуемого полимера имеет тот же порядок, что и для декстрана. Универсальная калибровка, в основе которой лежит определение зависимости между Ve и IgM-JT ] ] ( где [ TJ ] - истинная вязкость, которая служит мерой гидродинамического объема молекулы в растворе) [127], может быть использована только в случае достаточно длинной полимерной цепи. Несмотря на непрекращающиеся попытки [ 129, 1301 найти некую общую зависимость, справедливую для всех полисахаридов, калибровку колонок по охарактеризованным фракциям исследуемого полисахарида, видимо, не удастся заменить. Выделение узких фракций для определения их характеристик ( такими методами, как ультрацентрифугирование, светорассеяние и др.) требует применения препаративной СЭХ, которую раньше считали медленным процессом. Однако появление в последнее время сорбентов, которые могут быть использованы в условиях высокоскоростной жидкостной хроматографии, должно в значительной степени сократить время подобного рода препаративного фракционирования. [33]
Разрешающую способность колонки и зависимость ее от количества загружаемого образца нетрудно определить с помощью химически чистых низкомолекулярных веществ. Аналогично можно получить кривую элюирования повторно разделенной фракции в той же системе. Методом итераций можно уточнить предположения о распределении исходного образца и учесть диффузионное уширение, обусловленное увеличением молекулярного веса. При этом соответствие между рассчитанными и получаемыми в эксперименте кривыми повторного элюирования свидетельствует о том, что распределение по размеру молекул в исходном образце и калибровка колонки установлены правильно. [34]
Наиболее изученным представителем этой группы полимеров является полистирол. Практически все фундаментальные исследования механизма разделения полимеров методом ГПХ, а также влияния переменных факторов на эффективность разделения выполнены с использованием полистирола. Все эти вопросы рассмотрены в начальных главах данной книги. С одной стороны, это объясняется безусловной практической ценностью полистирола как полимерного материала. С другой, полистирол является просто удобным объектом исследования. Этот полимер характеризуется высокой растворимостью в большинстве подходящих для ГПХ растворителей; детально изучено поведение макромолекул полистирола в растворах, и, что не менее важно, узкие фракции полистирола, необходимые для калибровки колонок, выпускают в промышленных масштабах. [35]