Пептидные карты

Cтраница 3

У людей, страдающих серповиднокле-точной анемией, ген, ответственный за синтез Р - цепи гемоглобина, вследствие необратимой мутации кодирует включение остатка валина в положение, где в нормальном гемоглобине находится остаток глутаминовой кислоты; при этом все остальные аминокислоты Р - цепи занимают свои обычные положения. Многие из этих мутаций были выявлены при помощи электрофоретических тестов, а также из анализа пептидных карт гемоглобина, выделенного из крови больных, у которых эритроциты имели те или иные отклонения от нормы. [31]

Схема прибора для нисходящего бумажного электрофореза. [32]

Максимальное напряжение составляет 1500 В, а длительность анализа обычно не превышает 90 мин. Этот прибор пригоден также для двухмерного разделения комбинированным методом, сочетающим электрофорез и хроматографию, применяемым для получения пептидных карт. [33]

ATCC 39 709) было отмечено, что лиофилизированный препарат обладает такими же показателями энзимспецифической активности, относительной молекулярной массы, пептидных карт и реактивности по отношению к антителам, вырабатываемым против а-амилазы из В. [34]

Этим методом впервые обнаружено, что при замене одного остатка глутаминовой к-ты в молекуле гемоглобина на остаток валина образуется серповидноклеточный гемоглобин, встречающийся при одном из видов анемии. Методом пептидных карт изучают генетич. [35]

Тонкие различия в первичной структуре родственных белков часто удается выявить методом отпечатков пальцев. Метод этот состоит в том, что белок подвергают частичному перевариванию с помощью одного или нескольких протеолитических ферментов, а затем разделяют продукты гидролиза и идентифицируют их, пользуясь для этого либо электрофорезом, либо хроматографией на бумаге. Детальное изучение этих пептидных карт показывает, что все пептидные пятна, за исключением одного, идентичны. Таким способом генетически измененный структурный элемент выявляется очень легко, и для установления природы структурного изменения нет надобности устанавливать полную аминокислотную последовательность всей молекулы. Действительно, в ряде случаев весьма определенные указания относительно природы имеющегося замещения можно получить просто исходя из результатов анализа аминокислотного состава соответствующих пептидов, выделенных из двух белков. Но, конечно, однозначные доказательства замены одной аминокислоты на другую получают только после установления аминокислотной последовательности анализируемых пептидов. [36]

При этом гемоглобин фокусируется в области его изоточки, но не разделяется на компоненты. В ходе исследований было показано, что при электрофокусировании на бумаге достигается более низкое разрешение белков и амфотер-ных красителей, чем при фракционировании в геле. Однако этот метод, возможно, найдет применение для фракционирования некоторых классов соединений низкого и среднего молекулярного веса или для разделения в одном направлении при получении пептидных карт. [37]

Пептидная карта триптического гидролизата миозина. [38]

Авторы работы [40] указывают, что за день можно приготовить 8 пептидных карт. На рис. 21 представлена пептидная карта триптического гидролизата миозина. [39]

С-концевой остаток не является аргинином или лизином. На практике, однако, часто встречаются некоторые отклонения вследствие медленного расщепления некоторых арги-ниновых и лизиновых связей, приводящего к тому, что дочерние и слаборасщепляющиеся исходные крупные пептиды могут отделяться друг от друга при дальнейшем фракционировании. Если триптическии гидролиз длится многие часы, то вследствие имеющегося в препарате трипсина даже незначительного, примесного количества химотрипсина могут появиться следовые количества лишних пептидов. Другая трудность заключается в том, что еще нет уверенности в абсолютной воспроизводимости самого метода пептидных карт. Поэтому очень важно делать одновременно пептидные карты сравнения. [40]

Фракционирование пептидов на ионообменных смолах основано на целом ряде принципов, о которых уже говорилось выше ( гл. Сюда входят и различия в электрохимических свойствах разделяемых фрагментов, и различное сродство неполярных радикалов к бензольным кольцам матрицы смолы, и изменение концентрации конкурирующих ионов в буферном растворе. Это изменение концентрации ионов и рН может осуществляться линейно или ступенчато. Элюируемые компоненты идентифицируют нингидриновой колориметрией, лиофилизуют ( высушивают из замороженного состояния) и проверяют на гомогенность с помощью хроматографии на бумаге и методом пептидных карт. Негомогенные пики фракционируют дополнительно. [41]

Ферментативные методы гидролиза основаны на избирательности действия протеолитических ( вызывающих распад белков) ферментов, расщепляющих пептидные связи, образованные определенными аминокислотами. В частности, пепсин ускоряет гидролиз связей, образованных остатками фенилаланина, тирозина и глутаминовой кислоты, трипсин - аргинина и лизина, химотрипсин-триптофана, тирозина и фенилаланина. Ряд других ферментов, например папаин, субтилизин, проназа и другие бактериальные протеиназы, также используется для неполного гидролиза белков. В результате полипептидная цепь расщепляется на мелкие пептиды, содержащие иногда всего несколько аминокислот, которые отделяют друг от друга сочетанными электрофоретическими и хроматографическими методами, получая своеобразные пептидные карты. Далее определяют чередование аминокислот в каждом индивидуальном пептиде. Завершается работа воссозданием первичной структуры полной полипептидной цепи на основании определения последовательности аминокислот в отдельных пептидах. [42]

Таким образом, результаты этих опытов показывают, что конформация молекулы, обусловливающая ее ферментативную активность, полностью определяется последовательностью аминокислот в полипептидной цепи. Для того чтобы остатки ци-стеина соединились правильно, не нужно никакого специального фермента. Образование специфических дисульфидных связей требуется, по-видимому, лишь для стабилизации активной кон-формации, а не для ее возникновения. В результате восстановления и последующего окисления рибонуклеазы образуется продукт, имеющий ту же ферментативную активность, ультрафиолетовый спектр, характеристическую вязкость, дисперсию оптического вращения и те же иммунологические свойства, что и нативный фермент. Пептидные карты, получаемые после ферментативного расщепления этих двух веществ, также идентичны. Если бы расположение дисульфидных связей в нативной и реконструированной рибонуклеазе было различным, пептиды, содержащие такие связи, не могли бы попасть на одинаковые места карты. [43]

Анализ этого типа состоит в параллельном ферментативном расщеплении сравниваемых белков и сопоставлении их электро-хроматограмм. Для этого на угол большого листа хроматогра-фической бумаги типа ватман № 3 наносится образец гидроли-зата, который затем подвергают электрофорезу при напряжении около 1 5 - 3 кв в пиридин-ацетатных или ацетат-формиатных буферных растворах. При этом исходная смесь разделяется на ряд фракций на основании различия электрохимических свойств соответствующих фрагментов белка. Однако полного разделения пептидных осколков электрофорез дать не может. Поэтому по окончании электрофореза лист высушивают и пятна подвергают хроматографическому разделению в перпендикулярном направлении с использованием различных систем растворителей. По окончании хроматографии лист высушивают и опрыскивают раствором нингидрина; пятна пептидов проявляются при кратковременном нагревании при 70 или при выдерживании листа в темноте в течение 12 - 24 часов. При соблюдении постоянства всех условий и стандартности материалов картина воспроизведения пептидных карт постоянна, и положения пятен от опыта к опыту совпадают с точностью от 3 до 5 мм. [45]

Страницы: 1 2 3