Липкий конец
Cтраница 4
Нативная плазмида может быть использована в качестве вектора только после соответствующей модификации. Сначала ее переводят в линейную форму при помощи рестриктазы с образованием тупых концов. Линкер присоединяют к ДНК, а затем при помощи соответствующей рестриктазы получают фрагмент ДНК с липкими концами. [46]
Выделив нужные ферменты в чистом виде, Берр поместил их в пробирку вместе с плазмидами. Рест-рикционные ферменты незамедлительно напали на кольцевые плазмиды. Результатом этой атаки на ДНК явилась пробирка, полная длинных, нитевидных фрагментов плазмидной ДНК с липкими концами. Вообще-то говоря, липнут эти концы избирательно: они слипаются только с другими кусками ДНК, которые появились в результате действия того же рестрикциоиного фермента. [47]
Выделив нужные ферменты в чистом виде, Берг поместил их в пробирку вместе с плазмидами. Рестрикцион-ные ферменты незамедлительно напали на кольцевые плазмиды. Результатом этой атаки на ДНК явилась пробирка, полная длинных, нитевидных фрагментов плаз-мидной ДНК с липкими концами. Вообще-то говоря, липнут эти концы избирательно: они слипаются только с другими кусками ДНК, которые появились в результате действия того же рестрикционного фермента. [48]
Для осуществления молекулярного клонирования недостаточно одних только ферментов рестрикции. Во-первых, водородные связи между теми четырьмя основаниями, которые образуют липкие концы, недостаточно прочны, чтобы удержать два объединившихся фрагмента ДНК. Этот фермент катализирует образование фосфо-диэфирных связей между концами полинуклео-тидных цепей, которые уже удерживаются вместе благодаря спариванию липких концов. [49]
Поскольку показанные свойства инвариантны относительно конкретного материала, из которого сделаны исходные ленты, аналогично должны веста себя и ленты молекулярных размеров, если их геометрические особенности будут аналогичны бумажным лентам. Прежде всего, для этого необходимо сконструировать молекулярный аналог ленты достаточной длины, обладающий следующими свойствами: во-первых, иметь реакционноспособные группы на концах ( липкие концы), используемые для внутримолекулярной циклизации ленты, и, во-вторых, состоять из двух нитей, связанных временными мостиками, разрыв которых после склеивания концов может служить аналогом действия ножниц на бумажной модели. [50]
Поскольку показанные свойства инвариантны относительно конкретного материала, из которого сделаны исходные ленты, аналогично должны вести себя и ленты молекулярных размеров, если их геометрические особенности будут аналогичны бумажным лентам. Прежде всего, для этого необходимо сконструировать молекулярный аналог ленты достаточной длины, обладающий следующими свойствами: во-первых, иметь реакционноспособные группы на концах ( липкие концы), используемые для внутримолекулярной циклизации ленты, и, во-вторых, состоять из двух нитей, связанных временными мостиками, разрыв которых после склеивания концов может служить аналогом действия ножниц на бумажной модели. [51]
Процедура состоит в следующем. Плазмиду, содержащую эту последовательность, разрезают с помощью Aval и, используя ДНК-полимеразу 1, достраивают липкие концы. Такие фрагменты имеют неидентичные липкие концы, и поэтому при последующем сшивании соединяются в одной ориентации. Подобный набор однонаправленных тандемных копий гена может быть встроен в экспрессирую-щий вектор. При этом тандемная последовательность может находиться в двух ориентациях относительно промотора, так что ее экспрессия будет происходить только в 50 % случаев. [52]
Рассматривая рис. 25.2, помните, что две комплементарные цепи ДНК считываются в противоположных направлениях. Некоторые рестриктазы производят ступенчатые надрезы. Такие концы называются липкими; их используют для воссоединения фрагментов ДНК. Например, широко используемая рестриктаза EcoRl образует липкий конец - ТТАА. Есть рестриктазы, формирующие тупые концы. [53]
 |
Электронные микрофотографии материала МСМ-41 с порами диаметром 2 ( а, 4 ( б, 6 5 ( в, 10 ( г нм. [54] |
В составе ДНК четыре строительных блока: аденин, цитозин, гуанин и тимин. Комплементарное спаривание аденина с тимином и гуанина с цитозином разных цепей осуществляется посредством водородных связей. Таким образом, последовательность мономерных нуклеотидов одной цепи комплементарна последовательности нуклеотидов другой цепи. Свободные концы ДНК в генной инженерии называются липкими концами ( sticky ends), они обеспечивают возможность дальнейшего наращивания разветвленных структур путем самосборки. На рис. 2.19 показаны разветвленная молекула ДНК и образование двухмерной решетки из крестообразных структур, соединенных липкими концами. Гостями в образованных полостях могут быть как макромолекулы, так и металлические наночастицы или нанопроволоки. Синтезированы и более сложные объемные структуры, в которых жестко переплетено несколько нитей ДНК. [55]
ДНК зрелых частиц имеет, как известно, линейную форму. В отличие от линейной ДНК Т - четных фагов ДНК фага А, при освобождении из вириона самопроизвольно образует либо кольца, либо линейные агрегаты. Это свидетельствует о том, что ДНК фага А, имеет липкие концы, соединяющиеся друг с другом за счет специфического спаривания оснований. [56]
Примером могут служить суперспиральные формы ДНК, выделенные из клеток, зараженных фагами ФХ174 и Я, которые в ходе репликации становятся кольцевыми. Макромолекулярное строение ДНК других фагов становится более понятным, если допустить, что какая-то стадия их биосинтеза проходит через образование кольцевой формы. Репликация кольцевой ДНК может сопровождаться образованием длинных непрерывных молекул, построенных из повторяющихся фрагментов, которые являются предшественниками молекул с липкими концами, молекул с начальными и концевыми повторяющимися последовательностями и молекул е циклическими перестройками. [57]
Липкие концы - особенность структурной организации ДНК, которая хорошо нл-люстрир уется таким примером. При нагревании ДНК бактериофага Я, до 65 С и последующем медленном охлаждении образуются молекулы с коэффициентом седиментации 37 S. Быстрое же охлаждение ведет к образованию молекул с коэффициентом седиментации 32 S. Это объясняется тем, что 5 -концы ДНК выступают за пределы комплементарных З - концов в виде взаимно комплементарных одиночных цепей. Основания липких концов спариваются, и линейная молекула ДНК превращается в кольцевую, которая при 65 С разрывается. Установлено, что липкие концы представлены последовательностью, состоящей из 12 мономерных звеньев. Результаты электрон-вой микроскопии показывают, что 37 S-форма ДНК является кольцевой, а 32 S-форма - линейной. Таким строением характеризуются ДНК лизогениаирующих бактериофагов. [58]
Используемые при клонировании рестриктазы выделяют из различных прокариот. Всего было получено более ста пятидесяти их разновидностей. Они отличаются друг от друга тем, чта узнают и расщепляют разные нуклеотидные последовательности. Сайты узнавания для большинства ферментов, используемых в генетической инженерии, представляют собой палиндромы из 4, 5 или б нуклеотидов. Неспаренные нуклеотиды липкого конца оканчиваются З - гидроксильной или б - монофосфатной группировкой в зависимости от фермента. [59]
В составе ДНК четыре строительных блока: аденин, цитозин, гуанин и тимин. Комплементарное спаривание аденина с тимином и гуанина с цитозином разных цепей осуществляется посредством водородных связей. Таким образом, последовательность мономерных нуклеотидов одной цепи комплементарна последовательности нуклеотидов другой цепи. Свободные концы ДНК в генной инженерии называются липкими концами ( sticky ends), они обеспечивают возможность дальнейшего наращивания разветвленных структур путем самосборки. На рис. 2.19 показаны разветвленная молекула ДНК и образование двухмерной решетки из крестообразных структур, соединенных липкими концами. Гостями в образованных полостях могут быть как макромолекулы, так и металлические наночастицы или нанопроволоки. Синтезированы и более сложные объемные структуры, в которых жестко переплетено несколько нитей ДНК. [60]
Страницы: 1 2 3 4